[发明专利]猪瘟活疫苗ST细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是猪瘟活疫苗的制备方法，具体地说，是通过传代细胞即ST细胞转瓶培养猪瘟病毒，制备猪瘟弱毒苗。属于生物工程领域。

背景技术

猪瘟(HC)是猪的一种高度传染性疾病。它遍布于世界各国，对经济造成巨大的损失。猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus CSFV)引起的一种高度接触性传染病，以很强的传染性和高致死率为特征，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，是世界粮农组织和各国政府密切关注的主要传染病之一，国际委员会《国际卫生法典》(2002版)中，猪瘟被列为A类15种法定传染病之一。目前有20多个国家宣布消灭猪瘟，我国尚未消灭。

猪瘟临床症状主要有以下几种：

1、急性猪瘟。病猪体温升高至40-42℃，精神沉郁、怕冷、嗜睡；病初便秘，随后出现糊状或水样并混有血液的腹泻，大便恶臭；结膜炎、口腔粘膜不洁、齿龈和唇内以及舌体上可见有溃疡或出血斑；后期鼻端、唇、耳、四脚、腹下及腹内侧等处皮肤上有出血点或斑。常继发细菌感染，以肺炎或坏死性肠炎多见。

2、慢性猪瘟。病猪体温升高不明显；贫血、消瘦和全身衰弱，一般病程超过一个月；食欲时好时坏，便秘和腹泻交替发生；耳尖、尾根和四肢皮肤坏死或脱落。慢性猪瘟存活者严重发育不良，成为僵猪。

3、非典型猪瘟。又称亚临床猪瘟。临床症状与解剖病变不典型，发病率与死亡率显著降低，病程明显延长，新生仔猪感染死亡率较高，大猪一般能耐过；怀孕母猪感染出现流产，出现胎儿干尸，死胎及畸形胎。

4、迟发型猪瘟。是先天感染的后遗症，感染猪出生后一段时间内不表现症状，数月后出现轻度厌食、不活泼、结膜炎、后躯麻痹，但体温正常，可存活半年左右后死亡。怀孕母猪感染低毒力猪瘟病毒可表现群发性流产、死产、胎儿干尸化、畸形和产出震颤的弱仔猪或外观健康实际已感染的仔猪。

尽管目前市场上有一些抗猪瘟的临床用药，但是现有药剂的针对性不强，疗效有限，而且，治疗性制剂多是发病后采用的，不能起到预防的作用。对于易感染猪瘟的猪群，每年定期的对猪接种猪瘟病毒疫苗是预防猪瘟的有效方法，其次应增强营养或药物干预，提高自身免疫力，通过药物提高机体抵抗力或免疫力也是一种预防猪瘟的有效方法。

目前，在我国免疫接种仍是猪瘟防制的重要措施，因而研制新型、安全、高效稳定的猪瘟疫苗对于预防和控制猪瘟具有重要意义。

对于该病的预防，我国研制的HCV兔化弱毒株(Lapinized Chinese strain，LC)疫苗的生产和应用对我国猪瘟乃至世界一些地区猪瘟病的防治起了十分重要的作用。对于该病毒的培养曾经使用过猪肾细胞系PK-15、IB-RS-2细胞系。但由于IB-RS-2细胞系在不断用HCV接种和传代过程中，能自发的减毒，且近年来经过nested PCR检测，此细胞系亲本早已被一抗原变异的HCV所污染，故ATCC已在1994年将此细胞系销毁。

总而言之，在使用宿主细胞系接种和传代HCV的过程中，主要受到以下几个方面的影响：原代细胞不形成单层、次代细胞老化脱落、试验兔对猪瘟兔化弱毒细胞苗的影响、对HCV特异敏感的优良细胞系。因此提高HCV滴度的细胞培养的好方法，必须能有效地解决以上几个问题。

发明内容

本发明的目的在于克服原有细胞系对HCV培养滴度偏低的不足，提供一种新的猪瘟活疫苗细胞转瓶培养方法，用来提高猪瘟活疫苗的抗原性，增强肌体的免疫力。

本发明的基本原理是：HCV在宿主内通过感染宿主ST细胞，进行复制，完成感染过程。首先，HCV吸附在ST细胞表面，并通过细胞膜的融合和(或)经受体介导的胞饮作用进入感染细胞。随后，病毒在细胞内进行基因整合，复制完后，释放到细胞外。当用猪瘟兔化疫苗接种猪时，会引起机体体液免疫和细胞免疫，抵制病毒的感染，增强机体的免疫力。其中，通过克服原代细胞不形成单层、次代细胞老化脱落、试验兔对猪瘟兔化弱毒细胞苗的影响，以及使用对HCV特异敏感的优良ST细胞系，可高效培养的猪瘟活疫苗细胞。

因此，本发明目的是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

1)通过兔体免疫HCV，采集定型热反应兔的脾脏作毒种。

2)制备ST单层细胞，并加入细胞生长液，置37℃转瓶培养箱内培养。

3)将采集定型热的兔脾以0.2％～0.3％的浓度接种ST单层细胞上，再加入细胞生长液置37℃转瓶培养箱内培养。

4)培养5天后进行病毒液1收，以后每隔4天进行一收，所收获的病毒液经过真空冷冻冻干，即成猪瘟活疫苗。