[发明专利]利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用

权利要求书

1.一株提高1，3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏 杆菌(Klebsiella sp.)菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：M 208134。

2.根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是构建所用的表达载 体pETPkan-dhaT，采用卡那霉素抗性基因启动子Pkan。

3.根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是扩增了来自克雷伯 氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT。

4.根据权利要求1所述的重组克雷伯氏杆菌，其特征是达到克雷伯氏杆菌 自身的1，3-丙二醇氧化还原酶加强表达，来提高发酵法生产1，3-丙二醇的产 量。

5.权利要求1所述重组克雷伯氏杆菌的构建方法，其特征是将来自克雷伯 氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT，构建克雷伯氏杆菌表达载体 pETPkan-dhaT；将该表达载体pETPkan-dhaT转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组 克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)菌株CCTCC NO：M 208134；

(1)质粒pETPkan的构建：

以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下：

P1：5’-cgc aga tct GTA TCT CAG TTC GGT GTA GG-3’

P2：5’-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3’

PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P1和P2各1.5μL， 2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL， 模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分 钟、54℃1分钟、72℃延伸2分钟，循环30次；

通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR 片段回收试剂盒回收0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段经Bgl II和EcoR I 双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pET28a经过BamH I和EcoR I双 酶切，用PCR片段回收试剂盒纯化；用T₄连接酶连接两酶切纯化好的片段，连 接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉 素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用Bgl II和EcoR I双酶切， 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷 冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan，阳性重组子命名为JM109/pETPkan；

(2)质粒pETPkan-CMcds的构建：

以质粒pACYCDuet为模板进行PCR扩增氯霉素编码结构基因CMcds，所 用引物如下：

P3：5’-cgc gaa ttc Atg Gag Aaa AaaAtc Act Gg-3’

P4：5’-cgc aag ctt tta cgc ccc gcc ctg cca ctc-3’

PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P3和P4各1.5μL， 2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL， 模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分 钟、54℃1分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；

用试剂盒回收0.7kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III 双酶切，回收；同时提取质粒pETPkan，并用EcoR I和Hind III双酶切，回收 纯化；用T4连接酶连接两酶切纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌JM109感 受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼 脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶切，琼脂糖 凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冷冻保存 于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-CMcds，阳性重组子命名为 JM 109/pETPkan-CMcds；

(3)质粒pETPkan-CMcds转化克雷伯氏菌：

质粒pETPkan-CMcds用氯化钙法转化克雷伯氏菌感受态细胞，转化物涂布 于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜； 发现有大量单菌落生成；

(4)质粒pETPkan-dhaT的构建：

以克雷伯氏菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增1，3-丙二醇氧化还原酶 编码基因dhaT，引物序列如下：

P5：5’-ACCGGAATTCATGAGCTATCGTATGTTTG-3’

P6：5’-ACC GAAGCTTTC AGA ATG CCT GGC G-3’

PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mmol/L的引物P5和P6各1.5μL， 2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL， 模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5分钟；94℃变性1分 钟、54℃1.5分钟、72℃延伸2分钟，循环35次；

通过琼脂糖凝胶电泳分析纯化反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR 片段回收试剂盒回收1.2kb的目标片段；纯化好的目标片段经EcoR I和Hind III 双酶切，用PCR片段回收试剂盒回收；载体pETPkan经过EcoR I和Hind III双 酶切，用PCR片段回收试剂盒纯化；用T₄连接酶连接两酶切纯化好的片段，连 接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉 素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；提取质粒，分别用EcoR I和Hind III双酶 切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中， 冷冻保存于-80℃；重组质粒命名为pETPkan-dhaT，阳性重组子命名为 JM 109/pETPkan-dhaT；

(5)重组克雷伯氏杆菌CCTCC NO：M 208134的构建：

取一支冷冻保存的JM109/pETPkan-dhaT，接种于20mL含50μg/mL卡那 霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒pETPkan-dhaT，用氯化钙法转 化克雷伯氏杆菌感受态细胞，转化物涂布于含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平 板，37℃培养过夜；有大量单菌落生成，即为重组克雷伯氏杆菌CCTCC NO： M 208134。

6.用权利要求1所述重组克雷伯氏杆菌发酵生产1，3-丙二醇的方法，其 特征是：

出发菌株：重组克雷伯氏杆菌CCTCC NO：M 208134；

培养基组成：种子培养基以g/L计：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10；

发酵培养基以g/L计：甘油50，酵母膏5，KH₂PO₄ 5，(NH₄)₂SO₄ 0.1，柠檬 酸4，微量元素溶液60mL，维生素B12的添加量为发酵培养基中维生素B12 终浓度15mg/L，初始pH 7.0；

所述微量元素溶液每升含有：0.68g ZnCl₂，2.0g MnCl₂·4H₂O，60mg H₃BO₃， 0.47g CoCl₂·6H₂O，5mg Na₂MoO₄·2H₂O，17g CuCl₂·2H₂O，5.4g FeCl₃·6H₂O和质 量浓度37％的HCl 10mL；

培养条件：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入装液量为50mL 的250mL摇瓶中，于旋转式摇床中37℃、140r/min培养20h得到种子液， 按照5％接种量接入装液量为50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，发酵30h。