[发明专利]利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用

说明书

技术领域

利用卡那霉素抗性基因启动子表达的重组克雷伯氏菌及其应用，涉及卡那霉素抗性基因启动子在提高克雷伯氏菌1，3-丙二醇产量中的应用，属于基因工程技术领域。 

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-Propanediol，1，3-PD)是一种重要的化工原料，作为医药和有机合成的中间体用于食品、化妆品和制药等行业，1，3-丙二醇最重要的用途就是作为合成新型聚酯如聚对苯二甲酸-1，3-丙二醇酯(PTT)的单体，因而1，3-PD在纺织、地毯以及工程塑料领域也具有非常广阔的应用前景。1，3-丙二醇生产主要采用化学方法，但因环境污染、石油资源紧张等，使其进一步发展受到限制。欧美国家积极开展用肠道细菌和梭状芽孢将甘油转化为1，3-PD的研究，Dupont公司开发的由葡萄糖合成1，3-PD，进而合成PTT的工艺，被授予2003年美国总统绿色化学奖。 

目前，应用自然菌株发酵生产1，3-丙二醇得到了广泛的关注，其能以甘油作为唯一的碳源和能源发酵生产1，3-PD。自然菌株主要集中在克雷伯氏杆菌属、弗氏柠檬杆菌属和梭状芽孢杆菌属。人们对克雷伯氏菌研究较早，对其代谢途径认识比较清楚，有研究表明，克雷伯氏菌以甘油为底物生产1，3-PD，经过以下两步反应，即甘油在甘油脱水酶(GDHt)的作用下生成中间产物3-羟基丙醛；3-羟基丙醛在1，3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)的催化下生成1，3-PD。 

从目前研究的现状看，克雷伯氏杆菌(Klebsiella.sp)发酵甘油的底物转化率、产物浓度和生产强度都比较高，因此是一种有希望实现工业化的方法。然而相比化学法合成1，3-PD的价格，微生物发酵法目前没有明显的成本优势，其主要的原因是发酵液中产品的浓度和发酵强度低，从而使生产成本相对较高，为取得更大的经济效益尚存障碍，因此，为进一步降低生产成本，开发提高1，3-PD发酵液中产品浓度及生产强度的克雷伯氏基因工程菌成为研究的重点。如利用分子生物学技术将甘油合成1，3-PD关键酶基因转入克雷伯氏菌内，增强甘油合成1，3-PD代谢流通量，从而提高克雷伯氏菌的生产强度；或将葡萄糖合成甘油关键酶基因导入克雷伯氏菌中，扩大克雷伯氏菌的底物利用范围，即能以廉价的碳水化合物如葡萄糖为底物直接生产1，3-PD，以降低生产成本，提高产品的竞争力。 

然而，构建一种高效的表达系统是利用途径工程改造克雷伯氏菌的前提和 基础。本发明将利用分子生物学技术构建了一种新型表达载体，该载体能在克雷伯氏菌中复制和启动外源基因的表达。为进一步利用代谢工程手段改造克雷伯氏菌，开发更具生产潜力的克雷伯氏基因工程菌打下坚实的基础。 

发明内容

本发明的目的是构建一种新型的表达载体为进一步对克雷伯氏菌进行改造奠定基础。本发明的新型表达载体能在克雷伯氏菌中复制和启动外源基因的表达。为进一步利用代谢工程手段改造克雷伯氏菌，开发更具生产潜力的克雷伯氏基因工程菌打下坚实的基础。 

本发明的技术方案：一株提高1，3-丙二醇产量的重组克雷伯氏杆菌，其分类命名为克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208134。 

所述的重组克雷伯氏杆菌，其构建所用的表达载体pETPkan-dhaT，采用卡那霉素抗性基因启动子Pkan。 

所述的重组克雷伯氏杆菌，其扩增了来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT。 

所述的重组克雷伯氏杆菌，达到克雷伯氏杆菌自身的1，3-丙二醇氧化还原酶加强表达，来提高发酵法生产1，3-丙二醇的产量。 

所述重组克雷伯氏杆菌的构建方法，将来自克雷伯氏杆菌1，3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT，构建克雷伯氏杆菌表达载体pETPkan-dhaT；将该表达载体pETPkan-dhaT转入克雷伯氏杆菌中，获得了重组克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)pETPkan-dhaT； 

(1)质粒pETPkan的构建： 

以质粒pET28a为模板，进行PCR扩增，所用引物如下： 

P1：5’-cgc aga tct GTA TCT CAGTTC GGT GTA GG-3’ 

P2：5’-cgc gaa ttc AAC ACC CCT TGT ATT ACT G-3’