[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35

权利要求书

1.猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)重组腺病毒rAd-HS35，其特征在于，重组腺病毒rAd-HS35在分类上属于：腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，分类命名：腺病毒(重组)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期为2008年3月4日，保藏号为：CGMCCNo.2392。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35，是通过以下方法构建而成的：

1)PCR扩增副猪嗜血杆菌HSP70基因

设计一对针对副猪嗜血杆菌HSP70全基因序列简并引物，引物序列如下：

Uhsp1-11    5-MGNATHGGNATHAAYATGGGNAARATHATHGG-3

Dhsp625-634 5-YTTRTTNTCYTTNACYTCYTCRAAYTCNGC-3

利用上述简并引物，以副猪嗜血杆菌SH051201分离株基因组DNA为模板，通过常规PCR技术，扩增得到HSP70基因；将得到的HSP70基因克隆至pMD18-T载体，得重组质粒pMD18-T-HSP70；经基因测序，得到HSP70基因序列；

根据得到的HSP70基因序列，设计合成针对HSP70的特异性引物：

HSP70KpnI     5-TATGGTACCATGGGGAAGATCATCGG-3

QS HSP70XhoI  5-TTACTCGAGACCGCCACCGCCACCGAGATTTTTGTTGT-3

以HSP70 KpnI为上游引物，QS HSP70 XhoI为下游引物，以pMD18-T-HSP70质粒为模板进行PCR扩增，扩增出1908bp的HSP70基因；

2)PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3、GP5基因

参照PRRSV SY0608株基因序列设计引物：

SY-GP3.1 5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3

SY-GP3.2 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3

SY-GP5.1 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3

SYGP5.2  5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3

提取PRRS病毒SY0608毒株感染后的猴肾细胞MARC-145细胞的总RNA，以反转录后的cDNA产物为模板，以SY-GP3.1和SY-GP3.2为上下游引物扩增出不含终止密码子的大小约780bp的GP3基因；以上下游引物SY-GP5.1和SYGP5.2扩增出含终止密码子的大小约620bp的GP5基因；

3)目的基因HSP70，GP3及GP5的回收与纯化

用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段，具体操作按TaKaRa凝胶回收试剂盒的说明书进行；

4)重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5的构建

连接反应体积为10.0μL，体系如下：1.0μL 10×Ligase Buffer，1.0μL双酶切处理的pShuttle-CMV，4.0μL双酶切处理的GP3基因，3.5μL双酶切处理的GP5基因，0.5μL T4DNALigase，混匀后4℃连接8～10h；

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转化感受态DH5a，获得重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5；

5)重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35即pSh-HS35的构建

连接反应体积为10.0μL，体系如下：1.0μL 10×Ligase Buffer，1.0μL双酶切处理的穿梭载体pShuttle-CMV-GP3-GP5，2.0μL双酶切处理的HSP70基因，100U T4 DNA Ligase，用无菌双蒸水补至总体积10.0μL，混匀后4℃连接8～10h，获得重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35；

用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转化感受态DH5a，获得重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35；

6)重组穿梭载体pShuttle-CMV-HS35与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183大肠杆菌中同源重组

重组穿梭载体质粒pShuttle-CMV-HS35线性化、去磷酸化后，常规方法电转化感受态含pAdEasy-1的BJ5183，电转化后涂布带有Kan抗性的LB平板，37℃过夜培养20-24h，获得重组腺病毒质粒rAd-HS35；

7)重组腺病毒rAd-HS35的包装

重组腺病毒质粒rAd-HS35的线性化与回收后，将得到的线性化的重组腺病毒质粒转染293A细胞，当转染的细胞出现特征病变或细胞状态不足以维持时，—20℃冻存收获病毒。