[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-HS35

说明书

一、技术领域

本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒rAd-HS35及疫苗属于生物技术高科技领域，专用于加强猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用及减少猪场的经济损失。

二、背景技术

重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很多应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。因为重组腺病毒具有宿主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体，回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。

目前应用的PRRS弱毒苗和灭活苗对变异的PRRSV感染不能提供有效的保护作用，证明了变异的PRRSV在抗原性、致病特性上和传统的北美型毒株发生了很大的变化；具有中和活性的GP3、GP4和GP5蛋白在病毒粒子中产生少，难以诱导产生有效的中和抗体；本实验室(W.Jiang等，Enhanced immune responses of mice inoculated recombinant adenovirusesexpressing GP5 by fusion with GP3 and/or GP4 of PRRS virus，Virus Research 136(2008)50-57)的研究结果表明GP3和GP5基因串联后所构建的重组腺病毒能够有效刺激机体产生中和抗体。

研究证明细菌的HSP70(Brahm H.Segal等，Drug Discovery Today，volume 11，numbers11/12 June 2006)，除了作为分子伴侣，还具有很高的免疫原性，且在机体抗微生物感染过程中发挥重要作用。细菌热休克蛋白与抗原基因融合表达后免疫机体，能够诱导抗原特异性的体液及细胞免疫，尤其是可以诱导快速持久的抗原特异性CTL反应。这一特点已经得到了广泛的证明与应用。针对PRRSV的抗原特异性CTL免疫应答对PRRSV的清除起着重要作用。目前还没有构建成副猪嗜血杆菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的重组腺病毒报道。

三、发明内容

技术问题 本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的重组腺病毒rAd-HS35及疫苗，使在当前PRRS难以防治的情况下有新的突破。

技术方案 本发明的实施方案如下：

猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，其特征在于，重组腺病毒rAd-HS35在分类上属于：腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Humanadenovirus)，分类命名：腺病毒(重组)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋白。该重组腺病毒已在中国中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期为2008年3月4日，保藏号为：CGMCC No.2392。

上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：

(1)猪繁殖与呼吸综合征GP3、GP5基因的扩增、克隆

参照PRRSVS Y0608株基因序列(GenBank登录号：EU144079)设计引物：

SY-GP3.1 5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3

SY-GP3.2 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3

SY-GP5.1 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3

SYGP5.2 5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3

提取PRRS病毒SY0608毒株感染后的猴肾细胞MARC-145细胞的总RNA，以反转录后的cDNA产物为模板，得到不含终止密码子的GP3及含终止密码子的GP5基因。通过基因两端引入的酶切位点，将GP3、GP5串联克隆入穿梭载体pShuttle-CMV中，得到重组穿梭质粒pShuttle-CMV-GP3-GP5。

(2)副猪嗜血杆菌热休克蛋白基因的扩增与克隆

根据副猪嗜血杆菌HSP70基因序列(Genbank登录号：EU693116)，设计了一对特异性引物，序列如下：

HSP70KpnI：5-TATGGTACCATGGGGAAGATCATCGG-3

QS HSP70 XhoI：5-TTACTCGAGACCGCCACCGCCACCGAGATTTTTGTTGT-3