[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35

权利要求书

1.猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35，其特征在于：重组腺病毒rAd-GF35在分类上属于： 腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)， 分类命名：腺病毒(重组)，该重组腺病毒已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行 保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2391。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：

(1)GMCSF及PRRSV GP3、GP5基因的扩增、克隆根据猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的 GenBank登录号U67175序列设计三条引物：

GMCSF-P1：5-GCT GGTACCATGGCTCCTACCCGCCCA-3

GMCSF-2AP2.1s：5-GACGTCGCCGGCCAACTTGAGAAGGTCAAAGTTCTTTTTGACTGGCCCC-3

GMCSF-2AP2.2s：5-GCACTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3

以刀豆素ConA对分离的猪外周血淋巴细胞进行刺激，然后提取淋巴细胞的总RNA，以总RNA 反转录后的产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出包含口蹄疫病毒2A基因和缺失终止密码子的猪粒 细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF基因；

设计针对PRRSV国内分离株SY0608毒株GP3蛋白和GP5蛋白基因的特异性引物：

SY-GP3.1：5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3

SY-GP3.2：5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3

SY-GP5.1：5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3

SYGP5.2：5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3

以SY0608毒株感染的猴肾细胞MARC-145细胞的cDNA产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出 了国内PRRSV分离株SY0608病毒株缺失终止密码子的GP3基因和GP5全基因；

在上下游引物5′端引入限制性内切酶酶切位点，通过酶切，把GMCSF、GP3、GP5基因克隆入 穿梭载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GMCSF、GP3和GP5基因的穿梭 载体pShuttle-CMV-GMCSF-GP3-GP5，简称pSh-GF35；

(2)穿梭载体pSh-GF35与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组鉴定好的含有GMCSF、GP3 和GP5基因的穿梭载体pSh-GF35经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电转化方法转化 入大肠杆菌菌株BJ5183中，在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体pSh-GF35和骨架载体pAdEasy-1 之间发生同源重组，经50μg/ml卡那霉素筛选获得了含有GMCSF、GP3和GP5基因的重组腺病毒质 粒；

(3)重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293A细胞，重 组腺病毒质粒在HEK293A细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-GF35。

3.用权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35制备的疫苗。

4.用权利要求1或2所述的重组腺病毒rAd-GF35制备疫苗的方法，其特征在于：

取用低温保存的PRRSV重组腺病毒按10⁴TCID₅₀接种长成单层的HEK293A细胞，当细胞病变达 70-90％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-GF35疫苗。