[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35

说明书

一、技术领域

本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒rAd-GF35及疫苗，属于 生物技术高科技领域，专用于加强猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用及减少 猪场的经济损失。

二、背景技术

重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很多 应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。因为重组腺病毒具有宿 主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体， 回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。而GP3 GP5蛋白是由猪繁殖与呼吸综合 征病毒PRRSV的ORF3 ORF5编码的大约41kD和25kD的糖蛋白，由其诱导的抗体具有 中和活性。用杆状病毒表达的GP5蛋白可以对怀孕母猪提供50％的保护力，此外用杆状 病毒表达的GP5、GP3免疫母猪产下的仔猪在断奶时PRRSV血清阴性。用巨细胞病毒启 动子控制下的GP5质粒免疫动物后，在猪和小鼠产生抗GP5的特异性中和抗体。单克隆 抗体试验证明针对GP5的单克隆抗体的中和活性要强于针对GP4的单克隆抗体，而且 GP5蛋白可以诱导细胞凋亡。GMCSF具有良好的佐剂作用，在抗病毒和抗肿瘤的研究 中被广泛应用，目前还没有将GMCSF应用到构建成猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的 重组腺病毒报道。

三、发明内容

技术问题 本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的 PRRSV重组腺病毒疫苗，使在当前PRRS难以防治的情况下有新的突破。

技术方案本发明的实施方案如下：

猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35，其特征在于，重组腺病毒rAd-GF35在 分类上属于：腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病 毒种(Human adenovirus)，分类命名：腺病毒(重组)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进 行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋 白。该重组腺病毒已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏 日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2391。。

上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的：

(1)GMCSF及PRRSV GP3 GP5基因的扩增、克隆根据猪GMCSF序列(GenBank 登录号为U67175)设计了可以扩增缺失终止密码子和插入口蹄疫2A基因的猪GMCSF 的三条引物，引物序列如下：

GMCSF-P1：5-GCT GGTACCATGGCTCCTACCCGCCCA-3

GMCSF-2AP2.1s：

5-GACGTCGCCGGCCAACT TGAGAAGGTCAAAGTTCT TTTTG ACTGGCCCC-3

GMCSF-2AP2.2s：

5-GCACTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3

以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA反转录产物为模板，应用RT-PCR技术扩 增出了含有2A基因缺失了终止密码子的猪GMCSF基因。

根据登录号EU144079PRRS高致病性毒株SY0608的基因设计了针对PRRSV国内 分离株SY0608毒株GP3、GP5基因的特异性引物，引物序列如下：

SY-GP3.1：5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3

SY-GP3.2：5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3

SY-GP5.1：5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3

SYGP5.2：5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3

应用RT-PCR技术扩增出了PRRSV国内分离株SY0608毒株的去除了终止密码子的 GP3基因和GP5全基因，在引物上引入限制性内切酶酶切位点。通过酶切，把GMCSF、 GP3和GP5基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV(购自STRATAGENE公司)中，然后通 过酶切和PCR鉴定，获得含有GMCSF、GP3和GP5基因的穿梭载体 pShuttle-CMV-GMCSF-GP3-GP5，简称pSh-GF35；