[发明专利]荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法

权利要求书

1.一种荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)沉积物样品的预处理：

(1a)取0.2g沉积物样品于离心管中，离心，去上清；

(1b)加1mL PBS缓冲液，充分混合后，离心，去上清；

(1c)重复步骤(1b)2～3次；

(1d)加入1mL的4％多聚甲醛固定液，充分混合，再加入0.2mol/L HCl 1mL，充分混合，4℃下过夜后，离心，去上清；

(1e)加入1mL PBS缓冲液，充分混合后，离心，去上清；

(1f)重复步骤(1e)1次；

(1g)加入PBS与98％乙醇按体积比1∶1的混合液1mL，混匀，-20℃下保存备用；

(2)样品的涂布与脱水：

(2a)将步骤(1g)得到的样品用蒸馏水稀释10倍，超声将细胞充分分散；

(2b)取10uL步骤(2a)得到的样品均匀涂布在载玻片上，置37-55℃下干燥1～2h；

(2c)将干燥后的载玻片按50％、80％和98％的酒精浓度顺序脱水各3min，放置5～10min，自然干燥；

(3)杂交与洗净：

(3a)在有盖小盒内放入吸水纸，将其用杂交缓冲液浸润，水浴保温为37～55℃；

(3b)将20uL含有探针的杂交缓冲液滴到载玻片上，盖上盖玻片；

(3c)将载玻片放入有盖小盒中，46℃杂交1.5～3h；

(3d)将杂交后的载玻片取出，在已保温至48℃的杂交洗脱液中沥一下，竖直放入盛有杂交缓冲液的容器中，48℃严格保温20min；

(3e)用蒸馏水冲洗载玻片的正反面，再用力甩干上面的水珠，晾干；

(3f)在载玻片上加入50uL DAPI，静置20min；

(3g)用蒸馏水冲洗，甩干水分，晾干；

(4)用荧光显微镜观察，根据不同的探针所引起的荧光反应鉴别沉积物中所包含的微生物群落；

其中，

步骤(3b)所述的含有探针的杂交缓冲液中，探针浓度为100ng/uL；

步骤(3b)所述的探针为NIT3和CNIT3、或NSO190、或ARCH915、或CREN537、或ALF1b、或BET42a、或GAM42a；

步骤(3)所述的杂交缓冲液含有0.01％(w/v)的SDS、20mmol/L pH8.0的Tris-HCl、0.9mol/L的NaCl和去离子甲酰胺，去离子甲酰胺的含量与探针相对应，探针为NSO190时，去离子甲酰胺为55％(v/v)；探针为NIT3、CNIT3、ALF1b或GAM42a时，去离子甲酰胺为40％(v/v)；探针为BET42a或ARCH915时，去离子甲酰胺为35％(v/v)；探针为CREN537时，去离子甲酰胺为20％(v/v)；

步骤(3)所述的杂交洗脱液含有0.01％(w/v)的SDS、5mmol/L pH8.0的EDTA、20mmol/L pH8.0的Tris-HCl和NaCl，NaCl的浓度与探针相对应，探针为NSO190时，NaCl浓度为40mmol/L；探针为NIT3或CNIT3时，NaCl浓度为56mmol/L；探针为ALF1b或GAM42a时，NaCl浓度为60mmol/L；探针为BET42a或ARCH915时，NaCl浓度为80mmol/L；探针为CREN537时，NaCl浓度为147mmol/L。

2.根据权利要求1所述的荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法，其特征在于所述的载玻片和盖玻片为经过清洗和包被的玻片。

3.根据权利要求1所述的荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法，其特征在于步骤(4)中通过如下方式鉴别微生物种群，与探针NIT3和CNIT3特异性结合的为亚硝酸氧化细菌，与探针NSO190特异性结合的为氨氧化细菌，与探针ARCH915特异性结合的为古生菌，与探针CREN537特异性结合的为泉古菌、与探针ALF1b特异性结合的为变形菌α亚纲、与探针BET42a特异性结合的为变形菌β亚纲，与探针GAM42a特异性结合的为变形菌γ亚纲。