[发明专利]荧光原位杂交技术检测沉积物中微生物种群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说涉及荧光原位杂交技术(FISH)检测沉积物中微生物种群的方法。

背景技术

传统上，微生物群落结构的调查方法一直是建立在分离和培养的方法上。然而，由于环境微生物中只有一部分能被培养，进行微生物多样性分析时其结果往往是局限的，不能精确地反映混合菌群的组成和多样性，对于一些培养条件要求较苛刻或未被培养的细菌往往不能达到预期效果。因此用传统培养方法所得出的调查结果不能准确反映微生物群落的组成情况，建立和发展一种不依赖微生物培养的方法来进行微生物群落结构研究是非常必要的。

近几年，随着分子生物学技术如分子杂交、PCR、核酸测序等的发展，微生物学研究领域发生了深刻的变革，灵敏的检测和精确的细菌鉴定成为可能。借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段。上世纪80年代末至90年代以来，分子生物学技术开始被广泛应用于微生物群落结构分析，且发展迅速，研究的焦点集中在具有保守序列的16SrRNA上。研究方法包括分子杂交法、PCR法、SSCP法、DGGE法、TGGE法、RFLP法、ERIC-PCR法和克隆基因文库分析法等，具有很高的灵敏性，与传统的培养方法或其它不依赖培养技术的方法相比显示出明显的优越性，推动了微生物群落结构研究的快速发展。但是，这些基于PCR的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低所得信息的精确度。在实际工作中，用单一的分子生态学方法并不能完全达到预期的目的，常常需要综合运用多种分子生态学手段，有时甚至要结合传统方法，才有可能对复杂的微生态系统进行全面的分析。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)作为一种不依赖PCR的分子分析技术是以上各种分子标记技术的有益补充，它结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息，可以在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体，同时对微生物群落进行评价。目前，FISH技术广泛应用于微生物分子生态学和环境微生物学中，已成为微生物群落研究的重要技术手段。

FISH是一种重要的非放射性原位杂交技术，其原理是基于碱基互补的原则，用荧光素标记的已知外源DNA或RNA作探针，与载玻片上的组织切片、细胞涂片、染色体制片等杂交，与待测核酸的耙序列专一性结合，通过检测杂交位点荧光来显示特定核苷酸序列的存在、数目和定位。在微生物学研究中FISH检测最常使用的靶序列是16SrRNA，这是由于16S rRNA具有遗传稳定性，它的结构域具有保守区和可变区。对于每个分类水平，根据rRNA目标区域可设计寡核苷酸探针，进行种属特异性鉴定。16SrRNA基因比较测序在进行微生物鉴定时是最简便和准确的，尤其是对混合菌群和未被培养的微生物进行诊断时更为重要。在每个处于复制和代谢活跃的细胞中高拷贝的16SrRNA通常为监测单个细菌细胞提供了足够的靶序列。其他的靶序列如23S rRNA，18SrRNA和mRNA也被成功地用于FISH检测。根据序列的保守性和特异性设计所需要的不同分类级别的寡核苷酸探针，识别特异核苷酸序列的带标记的一段单链DNA或RNA分子，该探针与待测靶DNA同源互补，经变性—退火—复性形成靶DNA与核酸探针的杂交体。FISH中使用的寡核苷酸探针是一段长度为15～30bp，它容易渗透到目标细胞或组织中。通常在寡核苷酸探针的5’端通过共价键与简单荧光染料分子链接，经荧光检测系统对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。常用的荧光体有：荧光素(fluorescein)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、羰花青(如Cy3或Cy5)等。

关于FISH技术应用于环境样品中微生物群落结构的分析，许多研究都有所涉及，但没有应用于检测沉积物样品中微生物数量和分布情况的标准化方法。与纯培养菌液及活性污泥不同，由于沉积物样品成分组成复杂，样品镜检过程中，受到了样品中化学物质(如碳酸钙等)自身荧光的干扰，这就需要进行特殊的处理，以获得良好的效果。不仅这样，FISH实验过程中，由于固定方法或者洗脱不完全，很容易导致非特异性杂交，产生假阳性；杂交反应的时间也是一个重要的影响因素，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。因此，需要对FISH技术进行优化，使其很好地应用于沉积物样品微生物群落结构的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速检测沉积物中特定微生物的荧光原位杂交技术。

为解决上述技术问题，本发明的思路如下：