[发明专利]一种获取4型戊型肝炎病毒重组多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，特别涉及获取4型戊型肝炎病毒重组多肽的方法。

背景技术

戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是主要经消化道传播的无包膜单股正链RNA病毒，其引起的急性肝炎与甲型肝炎类似，在孕妇、原有慢性肝病、老年人等人群中病死率较高。我国是戊型肝炎的高发区域，发病率约占临床散发型肝炎的10％，近年来我国散发性戊型肝炎病例有逐年增多的趋势，并且主要以4型为主。

因缺乏可靠的HEV体外培养系统和病毒感染的小动物模型，目前对HEV抗原的研究主要依赖重组多肽。对于戊型肝炎病毒的研究主要集中与1型和2型，发现在其核衣壳蛋白羧基端集中了主要的免疫反应位点和中和免疫位点。

在本发明之前，对4型戊型肝炎病毒的主要免疫反应位点定位不明确，从而影响了针对中国人群的诊断试剂和疫苗的进一步研究。

在对戊型肝炎病毒的研究过程中，研究者还发现戊型肝炎患者血清中除了特异性抗-HEV抗体能够和主要免疫表位多肽发生结合反应，血清中其他一些物质也能够和主要免疫表位多肽发生非特异性结合，从而干扰了目前以抗原抗体反应为基础的戊型肝炎ELISA检测方法。

发明内容

本发明的目的就是要克服上述缺陷，提供一种4型戊型肝炎病毒重组多肽及其获取方法。

本发明的技术方案是：一种获取4型戊型肝炎病毒重组多肽的方法，其主要技术步骤为：

(1)采用Trizol抽提戊型肝炎患者血清中的总RNA，再利用RT-PCR技术分别扩增包含4型HEV ORF2的主要免疫表位多肽和截短多肽的基因片断；

(2)将扩增的基因片断插入表达载体pRSET-C；

(3)再将该质粒转化BL21(DE3)plyss感受态细菌，在IPTG诱导下进行表达；

(4)采用Ni-NTA树脂层析纯化，最终获得高纯度的重组多肽。

本发明的优点和效果在于提供了一种成本低、简便易行的获取4型戊型肝炎病毒主要免疫表位多肽及其截短多肽的方法，从而使4型戊型肝炎检测能够有效的进行。本发明所述的4型戊型肝炎病毒主要免疫表位多肽，位于ORF2的459-607位氨基酸，是构成主要免疫表位多肽的最短肽，仅由149个氨基酸组成(其核苷酸和氨基酸序列见SEQ ID NO：1)，能够形成结构相当稳定的二聚体，具有良好的抗原性和免疫原性。利用此多肽为包被抗原建立的ELISA方法可有效应用于抗-HEV的检测。

本发明所述的截短多肽为主要免疫表位区域在氨基端和羧基端分别截短13个或13个以内氨基酸残基后形成的重组多肽，截短多肽形成二聚体的能力消失，仅以单体形式存在，并不与患者血清(浆)抗-HEV抗体反应。可利用此特性来排除非特异性吸附对戊型肝炎检测的干扰。

本发明的其他优点和效果将在下面继续描述。

附图说明

图1——本发明中重组ORF2多肽的诱导表达图，其中1、2、3分别为经IPTG诱导0、2、4小时后ORF2多肽表达量变化情况；图上方的数值分别表示多肽在ORF2蛋白上的氨基酸(aa)起止位置。

图2——本发明中戊型肝炎患者血清与主要免疫表位多肽和截短多肽的反应性示意图，其中1-3分别表示：459-607多肽、472-607多肽和459-594多肽；A：显示纯化后的三种ORF2多肽；B和C：分别显示三种多肽和戊型肝炎病人阳性血清中的抗-HEV IgG和IgM抗体的反应性。

图3——本发明中ORF2主要免疫表位多肽及其截短肽检测血清抗-HEV IgM的OD450值示意图，其中459-607和472-607分别表示用HEV ORF2459-607多肽和472-607多肽包被ELISA板。

图4——本发明中人血清与重组ORF2多肽的非特异性吸附示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。

一、本实施描述了HEV ORF2基因片断的克隆方法：

采用Trizol提取戊型肝炎患者200μl血清总RNA，用随机引物逆转录合成cDNA，采用巢式PCR扩增ORF2基因片断，引物序列见表1。PCR反应条件为：94℃-30秒，55℃-30秒，72℃-60秒，35个循环。PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳后检测到大小约639bp的条带。琼脂糖凝胶回收纯化是使用北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，按照说明书操作即可。