[发明专利]一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法

权利要求书

1.一种运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是用合成的金纳米粒子与微囊藻毒素的包被原偶联得金连包被原，金纳米粒子与抗微囊藻毒素的抗体相连得金连抗体，用抗体和包被原的金纳米粒子进行免疫反应，在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应形成二聚体、寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布来测定微囊藻毒素的含量；包括免疫原、包被原、抗体的制备，纳米金的制备，抗体和纳米金的偶联，包被原和纳米金的偶联，包被原和抗体蛋白浓度的选择，抑制曲线的测定；

(1)免疫原的制备：

将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；

(2)包被原的制备：

将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；

(3)用步骤(1)得到的免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体；

(4)金纳米粒子的制备；

(5)将步骤(2)得到的包被原与步骤(4)得到的金纳米粒子偶联；

(6)将步骤(3)得到的抗体与步骤(4)得到的金纳米粒子偶联；

(7)对步骤(2)得到的包被原和步骤(3)得到的抗体蛋白浓度的选择；

(8)利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和金连包被原同时加入到一个离心管中，而后向离心管中加入金连抗体，混匀，通过微囊藻毒素和包被原与抗体进行竞争偶联，通过微囊藻毒素浓度的不同会使形成的粒子形成不同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR。

2.根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是免疫原的制备：

①取0.25mL溶解有MC-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入150μL的碳二亚胺，得A液；

②用1mL 25％的乙醇溶液溶解2mg的BSA，得B液；

③将A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的碳二亚胺，混匀，4℃反应12h。

3.根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是包被原的制备：

①取0.1mg MC-LR溶于0.1mL的N，N-二甲基甲酰胺DMF中，冷却至4℃，加入4.8μL的三丁胺，混匀； 

②向上述溶液中加入氯甲酸异丁酯2.7μL，混匀，4℃搅拌反应20min，得到A液；

③取卵清蛋白OVA 0.5mg溶于900μL pH＝9.0、50mmol/L的硼酸盐缓冲液中冷却至4℃，混匀得B液；

④将A液缓慢滴加至B液中，在4℃反应4h维持pH值在9.0；

⑤用pH值7.4的磷酸盐缓冲液透析三天。

4.根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是金纳米粒子的合成：所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 1％的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，溶液冷却至室温，稀释到100mL，4℃保藏。    

5.根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是包被原和纳米金的偶联：取13.4μL的蛋白浓度为3mg/mL的包被原在磁力搅拌器轻轻搅拌的情况下逐滴加入到4mL所述制备得到的金纳米溶液中，后在37℃反应30min，再加入80μL 10％的BSA溶液，37℃反应30min，10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀用碳酸钾调节pH为9.0的水溶液分散后用10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀，重复两次，放入4℃的冰箱中备用。

6.根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是抗体和纳米金的偶联：取12μL的蛋白浓度为3mg/mL的抗体在磁力搅拌器轻轻搅拌的情况下逐滴加入到4mL所述制备得到的金纳米溶液中，后在37℃反应30min，再加入80μL 10％的BSA溶液，37℃反应30min，10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀用碳酸钾调节pH为9.0的水溶液分散后用10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀，重复两次，放入4℃的冰箱中备用。