[发明专利]一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法

说明书

技术领域

一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法，属于免疫分析化学技 术领域。

背景技术

随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库，使 水体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins)，威 胁人类的饮用水安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins， MCs)的分布广、危害大更应引起重视。其是由某些种属的淡水蓝藻，主要是铜 绿微囊藻产生的一个结构相似的环七肽家族，已知有60余种异构体。其结构如 下：

其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、Y。其中X和Y分别为Leu 和Arg的最为常见，毒性也最大。基于此，世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的 藻毒素标准为1.0μg/L，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001， 0.001mg/L)和地表水环境质量标准(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR，0.001mg/L)。 故对藻毒素准确有效监测尤为重要。

常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法 等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等， 这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求 也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测 对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点 是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性 蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度 高，操作简单，专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本发明利用柠檬酸 三钠还原合成的金纳米粒子分别与微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗体 相连，在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应形成二聚体， 寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布来测定微囊藻 毒素的含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反 应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。

发明内容

本发明的目的是提供一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法， 灵敏度高，操作方便，线性范围宽。

本发明的技术方案：一种运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，用合成 的金纳米粒子与微囊藻毒素的包被原偶联得金连包被原，金纳米粒子与抗微囊 藻毒素的抗体相连得金连抗体，用抗体和包被原的金纳米粒子进行免疫反应， 利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应 形成二聚体，寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布 来测定微囊藻毒素的含量；包括免疫原，包被原，抗体的制备，纳米金的制备，抗 体和纳米金的偶联，包被原和纳米金的偶联，包被原和抗体蛋白浓度的选择，抑 制曲线的测定。

工艺步骤为：

(1)免疫原的制备：

将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；

(2)包被原的制备：

将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；

(3)用步骤(1)得到的免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体；

(4)金纳米粒子的制备

(5)将步骤(2)得到的包被原与步骤(4)得到金纳米粒子偶联；

(6)将步骤(3)得到的抗体与步骤(4)得到金纳米粒子偶联；

(7)对步骤(2)得到的包被原和步骤(3)得到的抗体蛋白浓度的选择；

(8)利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和金连包被原同时加入 到一个离心管中，而后向离心管中加入金连抗体，混匀，通过微囊藻毒素和包 被原与抗体进行竞争偶联，通过微囊藻毒素浓度的不同会使形成的粒子形成不 同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR。

所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其免疫原的制备：

①取0.25mL溶解有MC-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入 150μL的碳二亚胺，得A液；

②用1mL25％的乙醇溶液溶解2mg的BSA，得B液；

③将A液逐滴加入到B液中，再加入150μL的EDC，混匀，4℃反应12h。

其包被原的制备：