[发明专利]一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法

权利要求书

1.一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法，其特征是本方法应用于土壤、水或空气中的检测：

(1)检测靶基因的选择及引物设计

以土拉弗朗西斯菌的内毒素相关基因lpxF，lpxE和flmK为特异性靶点，通过NCBI微生物基因组全序列Blastp比对，确立上述三个基因的特异性，设计相关引物，其中lpxE从基因两端设计引物，lpxF和flmK均从基因内部保守区域设计引物，采用多重PCR进行检测；

引物序列如下：

lpxF(+)：TTGGCAAGATTTCATATCATATTAGG，

lpxF(-)：CATCACCACATACAAAGGAGCAG，

lpxE(+)：ATGCTCAAACAGACATTACAAACAAA，

lpxE(-)：AATAATCTCTCTATTTCTCATCCAATA，

flmK(+)：ATGAATAAATCTAAAAACTCTTACTATTT，

flmK(-)：AGTGATAATGGCGCAAATATAGGC，

(2)样品制备，以土拉弗朗西斯菌基因组DNA或土拉弗朗西斯菌为样品：

基因组DNA样品的提取：取土拉弗朗西斯菌过夜培养液3mL，利用TIANamp Bacteria DNAKit试剂盒抽提基因组DNA，用核酸定量检测仪测定，控制基因组DNA浓度为100μg/μL；

将所提取的DNA模板，分别以超纯水梯度稀释，反应体系中最终模板浓度为5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL；

或菌液样品的制备：取土拉弗朗西斯菌单菌落接种于10mL TSB-C液体培养基，于37℃、200rpm/min摇床上培养至OD₆₀₀值为1，通过菌落平板计数，控制为2.0×10⁹cfu/mL；

取OD₆₀₀＝1的菌液，进行梯度稀释，反应体系中菌体终浓度为1×10⁸cfu/mL，5×10⁷cfu/mL，1×10⁷cfu/mL，5×10⁶cfu/mL，1×10⁶cfu/mL，5×10⁵cfu/mL或1×10⁵cfu/mL；

(3)反应条件的确立

确定dNTP加量为2μL，Tm℃为55℃，三对引物比例lpxF∶lpxE∶flmK＝1∶1∶3；

反应体系为20μL：10×PCR Buffer：2μL，ddNTP：2μL，基因组DNA模板1μL或菌液样品1μL，Taq酶：0.1μL，引物：lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，lpxF(-)0.5μL，flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL，ddH₂O补足20μL；

多重PCR扩增程序及测定扩增片段的熔解温度程序为：变性94℃、5min；变性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、1min，循环30次；延伸72℃、10min；

(4)检测结果

1％琼脂糖凝胶电泳分析，于紫外光灯下观察结果，以447bp，717bp，1004bp三条特异性条带的出现判为阳性，否则判为阴性。