[发明专利]一种应用多重PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测土拉弗朗西斯菌的方法，特别是涉及一种通过多重PCR来快速检测土拉弗朗西斯菌的方法。属于生物战剂检测技术领域。 

背景技术

微生物个体微小，与人类生活密切相关。微生物在自然界中“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、环保等诸多领域。由微生物引起的传染病发病快、死亡率高、传播迅速、传播范围广，不仅严重危害着人民健康而且极易引起大众的心理恐慌，因此，微生物常常被恐怖分子选择用于制造生物恐怖事件的首选目标。随着现代生物技术的飞速发展，对某些烈性病原生物进行遗传改造，使其毒力增强或在其强致病性的基础上增加各种耐药基因，使之更加难于救治已愈来愈引起各国的重视。 

据《医学假说》杂志报道，加拿大一项最新研究表明，早在3300年前，人类就曾经在战争中使用过“生化武器”，这种“生化武器”就是土拉弗朗西斯菌。土拉弗朗西斯菌通过诸如驴等啮齿类动物，感染了人类和动物，并导致他们发烧、残疾和死亡。“生化武器”的使用，使瘟疫持续了35-40年。 

生化武器包括天花、炭疽、土拉弗朗西斯菌和鼠疫等致病菌。其中，土拉弗朗西斯菌是重要的生物战剂，已被列入国际禁止生物武器公约致病微生物核查清单。 

土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)能在人和其它许多温血动物中引起土拉菌病(Tularaemia，或称野兔热、鹿蝇热)，易感动物为啮齿类动物，人通过破损的皮肤、结膜感染，吸入或食入极少量(10～50个)土拉菌便可发病，临床表现为皮肤溃烂、淋巴腺肿大、肺部感染和伤寒样症状，病情严重甚至死亡。 

2001年6月美国微生物学报刊登了一篇“平民生物危害防范工作组”关于土拉菌作为生物武器进行恐怖袭击危险性评估报告，这个工作组由来自美国医学科研机队、政府有关部门的25名专家组成，通过检索1966年1月至2000年10月间的相关文献，最后得出结论，土拉菌具有用作生物武器进行恐怖袭击的潜在危险，其特点如下：(1)通过简易发酵即可大量得到；(2)易于传播，如通过空气和水传播，土拉菌具有较强的抵抗力，在水、土壤、尸体和 兽皮中可存活几周，在0℃耐受几个月，在冷冻的兔肉中存活几年，患者及病畜皮肤、腺体溃疡病灶分泌物、血、痰标本，或死亡动物肝、脾标本中，均含有大量土拉菌；(3)人和动物易感(少于10个菌即可感染)；(4)可引起致死性疾病。 

土拉菌是苛养菌，人工营养条件要求较高，尤其是初次分离培养比较困难，生长缓慢。因此，研究快速检出土拉菌的方法对于确定污染源和污染范围，及时诊断土拉菌感染，防止环境扩散和患者及时治疗十分重要，也是在突发事件中将生物危害减至最小程度的重要保证。 

土拉弗朗西斯菌常用的检测方法多为传统的生理生化试验，血清抗体检测，酶联免疫吸附试验(ELISA)和普通的PCR等，但检测时间长，灵敏度低，很显然，面对突然的生物袭击，上述方法均不能满足快速检测的需求。因此，研制开发灵敏度高，检测时间短的土拉弗朗西斯菌的检测方法显得尤为重要。 

多重PCR(multiplex PCR，MPCR)技术，是一种在一个反应体系中加入多对引物同时检测多个目的片段的技术，可以为单一模板也可以是几种不同的模板，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR在食源性致病菌的检验上已得到较好应用，可以同时检测一种致病菌的多个基因，也可以同时检测多种致病菌. 

多重PCR，只需一次反应和一次电泳即可同时检测出多个目的片段，节约昂贵试剂、PCR反应时间和电泳时间等，又由于各对引物扩增时存在竞争，可有效避免假阳性的出现而提高检测准确率。多重PCR方法与单一PCR相比，显得更加稳定、准确、高效、经济。 

综上所述，鉴于土拉弗朗西斯菌有作为生物恐怖武器进行生物恐怖袭击的潜在危害，开发一种能快速检测的方法显得尤为重要，本发明即通过多重PCR来检测土拉弗朗西斯菌，由此建立一种新的快速检测土拉弗朗西斯菌的方法。 

本发明所采用的土拉弗朗西斯菌株Francisella tularensis subsp.novicidaU112为实验室安全菌株，所有的实验均在生物安全二级实验室完成。 

发明内容

发明目的在于：克服当前检测方法的不足，提供一种检测速度快，灵敏度高，检测结果准确度高，重现性好的运用多重PCR技术快速检测土拉弗朗西斯菌的方法，以适应卫生和公安应急检测，适应疾控中心，商检，卫生，海关，公安，技术监督，科研的基层分析单位检测的需求。