[发明专利]聚乙二醇化红细胞生成素蛋白长效制剂

权利要求书

1.一类聚乙二醇化红细胞生成素，采用大肠杆菌表达人红细胞生成素蛋白，经体外复 性、纯化和聚乙二醇(PEG)化修饰获得，即由非糖基化的rhEPO(rhngEPO)或其点突变体 (rhngEPOm)与单一、单链的、分子量大于20kDa的PEG分子以N-末端氨基或半胱氨酸突 变点的巯基定点偶联而成；所述聚乙二醇化红细胞生成素具红细胞生成素的生物活性、且 与rhEPO相比具血浆清除半衰期明显延长和免疫原性明显降低的药理学特征；其特征在于： 所述聚乙二醇化红细胞生成素是PE-N-20、PE-N-30、PE-N-40、PE-K116C-30或PE-R131C-30 分子；其中所述：

PE-N-20：为分子量20kDa的mPEG丙醛或丁醛在rhngEPO N端的修饰产物；

PE-N-30：为分子量30kDa的mPEG丙醛或丁醛在rhngEPO N端的修饰产物；

PE-N-40：为分子量40kDa的mPEG丙醛或丁醛在rhngEPO N端的修饰产物；

PE-K116C-30：为分子量30kDa的mPEG-马来酰亚胺或mPEG-邻位吡啶硫醚 (mPEG-OPSS)定点偶联在第116位半胱氨酸突变位点rhngEPOm的修饰产物；

PE-R131C-30：为分子量30kDa的mPEG-马来酰亚胺或mPEG-邻位吡啶硫醚 (mPEG-OPSS)定点偶联在第131位半胱氨酸突位点rhngEPOm的修饰产物；

上述的mPEG为：甲氧基化的聚乙二醇；所述的mPEG丙醛或丁醛结构式为： mPEG-(CH₂)r-CHO，其中r＝3为丙醛、r＝4为丁醛；所述的mPEG马来酰亚胺结构式为：

所述的mPEG-邻位吡啶硫醚(mPEG-OPSS)结构式为：

且，上述的非糖基化红细胞生成素(rhngEPO)具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列；上述的rhngEPO半胱氨酸点突变体rhngEPOm是rhngEPO-K116C 或rhngEPO-R131C，其中rhngEPO-K116C的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由 Cys(C，半胱氨酸)点突变第117位Lys(K，赖氨酸)而获得，rhngEPO-R131C的氨基酸序列 是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由Cys(C，半胱氨酸)点突变第132位Arg(R，精氨酸) 而获得；

上述PE-N-20、PE-N-30或PE-N-40由如下分离纯化方法制得：使用缓冲液20mM～50mM 醋酸钠缓冲液，pH 3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡 Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPO反应液， 经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；再用上述平衡缓冲液平衡Superdex 75prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积， 收集出现的A280蛋白吸收峰，即为PE-N-20、PE-N-30或PE-N-40分子原液；

上述PE-K116C-30或PE-R131C-30由如下分离纯化方法制得：使用缓冲液20mM～50mM PBS缓冲液，pH 3.5～9.0，150mM～500mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯80溶液，平衡 Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，按50ml/分钟流速连续上样PEG-rhngEPO反应液， 经0～1M氯化钠溶液梯度洗脱，收集A280蛋白洗脱峰；再用上述平衡缓冲液平衡Superdex 75 prep grade凝胶层析柱，按30ml/分钟的流速上样，每次上样量为1/10～20柱体积， 收集出现的A280蛋白吸收峰，即为PE-K116C-30或PE-R131C-30分子原液。