[发明专利]聚乙二醇化红细胞生成素蛋白长效制剂

说明书

技术领域

本发明涉及一类聚乙二醇化(PEG)红细胞生成素，尤其涉及一类具药学上长效、高 效、低免疫原性特征的聚乙二醇化(PEG)红细胞生成素偶联化合物分子，其由单一、特 定的PEG分子定点偶联非糖基化的重组红细胞生成素蛋白或其点突变体而成。本发明所 述化合物分子与重组人红细胞生成素相比，在体外具有完全一致甚或更优的理化和生物 学性质，如溶解性、热稳定性、抗酶解稳定性和比活，在体内具有半衰期延长、活性增 加和免疫原性降低等药理学特征。本发明还涉及这类化合物分子的生产与应用，以及作 为药物制剂的组成成分。

背景技术

人体内源性红细胞生成素(Human Erythropoietin，hEPO)是一种糖蛋白激素，由 肾脏产生。hEPO的主要功能是刺激骨髓红细胞前体细胞的增殖与分化，以保持个体的红 细胞比容。正常生理状态下，血浆hEPO的含量很低，仅用于刺激替代因老化而损失的 红细胞；但当红细胞携氧减少时，血浆hEPO浓度明显升高，以加速红细胞的生成。hEPO 由165个氨基酸组成，分子量为30KDa～34KDa；有3个N-连接的糖链即Asn24，38和83， 和1个0-连接的寡糖链即Ser126构成hEPO的糖基，约占hEPO糖蛋白分子量的40％。 hEPO结构与功能的研究表明：①rhEPO与受体结合的序列涉及A、B、C、D螺旋结构和 rhEPO蛋白C末端的AB环；②去除hEPO分子的糖链明显降低hEPO的体外热稳定性； ③增加hEPO的N-糖链和/或增加糖链中的唾液酸的含量，可明显增加hEPO的体内半衰 期及活性；④无糖基化或去糖基化的hEPO，可保持甚或提高hEPO的体外活性，但却丧 失hEPO的体内活性；故糖基对维持hEPO的体外稳定性、体内活性和血浆半衰期具重要 作用。因此，目前开发的基因重组hEPO(Recombinant Human Erythropoietin，rhEPO) 药物均是由真核细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，CHO细胞) 生产的糖蛋白，如Epogen(由美国Amgen公司产品)和Epoetin(由美国Ortho Biotech 公司产品)。

临床上，rhEPO主要用于治疗慢性肾功能不全所致的贫血(Eschbach，JW et al. 〔1987〕NEJM316：73-78)，也可治疗爱滋病和肿瘤化疗所致的贫血，均取得了较好的 疗效与安全性。但rhEPO的血浆半衰期很短，生物利用度很低，需反复、长期应用才能 达到和维持临床疗效；这同时导致相当数目的病人出现抗EPO中和抗体，甚至导致严重 的红细胞再生障碍贫血(pure red cell aplasia)(见Bunn HF.N.Engl.J.Med. 2002；346：522-523)；且rhEPO价格昂贵，不适合慢性贫血病人的长期治疗。因此，客 观上需要开发更加安全、有效、方便的rhEPO长效剂型。

目前已经开发和正在开发的rhEPO长效制剂，几乎都是在rhEPO糖蛋白的基础上； 其中包括：①通过增加N-糖链的数目及其唾液酸的含量，而获得一周注射一次的rhEPO 长效制剂(如Darbepoetin新药)，该药由Amgen公司开发，是在rhEPO的基础上增加 了2条N-糖链，唾液酸也由原来的14个增加至22个，从而使其血浆清除半衰期从8.5 小时增加至25小时(约三倍)；②美国专利US6,340,742、US6,583,272、US6,586,398 和US6,930.086分别描述了通过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)与rhEPO糖蛋 白分子、rhEPO糖蛋白分子的突变体以及高糖基化红细胞生成素蛋白(Novel Erythropoietin Stimulating Protein，NESP)的偶联，而形成长效EPO制剂；③WO 94/28024专利描述了PEG与rhEPO分子的糖基定点偶联即GlycoPEGylation，而使 rhEPO的血浆半衰延长。上述rhEPO长效制剂的特点是：均在由CHO细胞生产的rhEPO 糖蛋白的基础上制备其长效制剂，故产率低、成本高；高糖基化rhEPO和PEG化rhEPO 糖蛋白均使rhEPO的体外活性及与EPO受体的结合力明显降低，影响长效制剂的疗效。