[发明专利]一种循环利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用重组酿酒酵母生产低聚半乳糖的方法，尤其涉及一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母及其制备方法以及循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。 

技术背景 

低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides，GOS)是一种具有天然属性的非消化类寡糖，是人类母乳中的主要成分，具有促进双歧杆菌增殖；降低龋齿发病率；保护肝脏，改善钙铁锌等矿物质的吸收；改善脂类代谢，降低血脂和胆固醇等功能。该类寡糖可通过微生物产生的β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成，制备方式有两种，一种是采用游离酶，另一种是采用固定化酶。游离酶在反应过程中不稳定，并且难以重复利用，不适合工业化生产，而固定化酶能有效提高酶的稳定性，可重复利用，适合于工业化生产。但固定化酶反应过程中存在副产物(葡萄糖)的抑制和酶的不断流失等问题，降低了其使用效率。因而迫切需要寻找简便高效的适合于固定化酶法生产低聚半乳糖的方法，提高固定化酶的使用效率，大大降低工业化生产成本。 

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母和循环利用该重组酿酒酵母发酵乳糖生产低聚半乳糖的方法。 

一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞，该重组酿酒酵母细胞含有插入了β-半乳糖苷酶基因序列的质粒载体。 

优选的，所述的β-半乳糖苷酶基因选自扩张青霉(Penicillium expansum)CGMCC No.2352中的β-半乳糖苷酶基因。 

一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下： 

1)将β-半乳糖苷酶基因插入酵母表面展示质粒pYD1，得重组质粒pYD1； 

2)将步骤1)构建的重组质粒pYD1转化大肠杆菌DH5α，然后从阳性重组大肠杆菌中提取含有β-半乳糖苷酶基因的重组质粒pYD1，再用该重组质粒pYD1转化酿酒酵母EBY-100，获得含有重组质粒pYD1的重组酿酒酵母； 

3)将步骤2)获得的含有重组质粒pYD1的重组酿酒酵母接种于YNB-CAA-葡萄糖培养液，30℃培养，当菌液OD₆₀₀为2.0～5.0时，3000转/分离心3～5分钟，收集重组酿酒酵母细胞；4)将步骤3)收集的重组酿酒酵母细胞用诱导产酶培养液重悬菌细胞，并调OD₆₀₀为0.5～1.0，20℃～25℃诱导38～42小时，3000转/分离心3～5分钟，收集已表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞。 

所述YNB-CAA-葡萄糖培养液成分：无氨基酸酵母氮源(YNB，购自Difco公司，产品号0919-15)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA，购自Sigma公司，产品号A2427)5g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。 

所述诱导产酶培养液成分：无氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA)5g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟；使用之前加入过滤除菌的半乳糖溶液至终浓度20g/L。

优选的，所述步骤1)中的β-半乳糖苷酶基因来源于扩张青霉(Penicillium expansum)CGMCC No.2352。 

优选的，所述步骤4)中的诱导产酶温度为20℃。 

优选的，所述步骤4)中的诱导产酶时间为40小时。 

一种表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞在生产低聚半乳糖的应用，其特征在于，先将表面展示β-半乳糖苷酶的重组酿酒酵母细胞悬于YNB-CAA-乳糖培养液，调OD₆₀₀为8.0～10.0，25℃培养4～6天；然后3000转/分离心3～5分钟，对离心后所得的上清液通过高效液相色谱分析其低聚半乳糖含量；将离心后所得的重组酵母细胞，重悬于新的YNB-CAA-乳糖培养液，按上述方法循环利用该重组酿酒酵母细胞发酵乳糖生产低聚半乳糖，并分析每个循环所得上清液的低聚半乳糖含量。 

所述YNB-CAA-乳糖培养液成分为：无氨基酸酵母氮源(YNB)6.7g/L，酪蛋白水解物(CAA)5g/L，乳糖100g/L，pH自然，115℃灭菌30分钟。 

本发明中所涉及的实验步骤及实验试剂，除有特别说明，均为本领域常规操作和普通市售产品。