[发明专利]传染性胰脏坏死病毒的快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物病原的检测技术，具体是一种采用环介导等温扩增技术对鱼类传染性胰脏坏死病毒进行快速检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术

传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，简称IPNV)属于双片段RNA病毒科、水生双片段RNA病毒属，可以引起鲑科鱼类鱼苗和幼鱼的急性传染病，是研究最早的鱼类病毒病。IPNV对水产养殖业造成了严重的危害，目前蔓延到加拿大、智利、丹麦、英国、法国、德国、意大利、日本、南韩、挪威、苏格兰、瑞典、美国、中国等国家。易感鱼类包括虹鳟、大西洋鲑、五条鰤、大菱鲆、欧洲黄盖鲽、庸鲽大西洋鳕等十余种常见养殖鱼类。患病鱼游动异常、体色发黑、眼突出、腹部肿胀，腹部包括腹鳍出血、鳃发白，有些病鱼肛门处拖着长长的、白色的排泄物，内脏器官多处出现点状出血或发白，肠道内无内含物。鉴于IPNV的严重危害性，世界动物卫生组织规定其为必报疫病。中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国和韩国进出口的的鲈鱼、真鲷、鲤鱼、鲫鱼、大菱鲆、牙鲆等必须进行传染性胰脏坏死病毒的检验检疫。

目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，但是需要昂贵的PCR仪器，另外需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，交叉污染问题比较严重。

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)技术，是一种敏感性高、特异性强的靶DNA快速检测方法，不需要昂贵的仪器，样品中含有少量的病原就能检出。环介导等温扩增目前已被广泛应用于检测水产动物病原，如鱼类病毒(鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒)、对虾病毒(对虾白斑综合症病毒、黄头病毒)、细菌(迟钝爱德华氏菌)等。据检索，目前尚未见采用环介导等温扩增技术对传染性胰脏坏死病毒进行快速检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用环介导等温扩增技术检测传染性胰脏坏死病毒的检测试剂盒，克服现有技术的不足，以满足现场即时检测的要求。

本发明的另一目的是提供这种检测试剂盒的检测方法，以方便在水产养殖业和国际鱼类贸易中对传染性胰脏坏死病毒进行快速检测中的应用。

本发明的主要原理为：LAMP技术是使核酸通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，从而达到检测的目的。基本程序是针对靶基因的6个区域，设计2对特异性引物，同时可以设计1-2条环引物以加快反应速度，利用一种链置换脱氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothermophilus DNApolymerase，简称Bst DNA聚合酶)，在恒温65℃左右反应约1h。Bst DNA聚合酶有两大特性：一是具有5′-3′聚合酶活性，能在恒温状态下扩增DNA核酸；二是Bst DNA聚合酶具有链置换活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。LAMP反应过程中，一对引物的5′端含有一段与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状的回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，Bst DNA聚合酶发挥链置换活性，后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链，从而保证了扩增的持续进行。LAMP反应形成一系列不同长度的具有茎环结构的DNA产物，可以通过荧光染料进行检测。

本发明的技术方案如下：

传染性胰脏坏死病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒，包括提供反应必须的Bst DNA聚合酶、逆转录酶、反应缓冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合液和荧光显色剂，以及提供一种使用该试剂盒检测鱼类样品中传染性胰脏坏死病毒的方法，以实现对传染性胰脏坏死病毒快速检测的标准化，为鱼类传染性胰脏坏死病毒的检测提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。。

本发明的传染性胰脏坏死病毒的环介导等温扩增快速检测试剂盒的配方如下：