[发明专利]禽流感疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽流感疫苗及其制备，尤其涉及禽流感疫苗制备中的重组质粒和重组病毒的制备。 

背景技术

禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亚型中的一些毒株引起的急性呼吸道传染病。动物禽流感大规模爆发，不仅给养殖户带来严重损失，也将会给国民经济带来重大损失，同时，也将会危害到人类的生存安全。 

动物禽流感疫苗是预防与治疗动物禽流感一种行之有效的方法。 

现有的疫苗是用鸡胚生产，生产商需要提前12个月订购鸡胚。病毒需要适应鸡胚后才能在鸡胚中生长，疫苗的生产周期较长。病毒在鸡胚的传代过程中病毒会发生变异，疫苗株与流行株之间的差异会降低疫苗的免疫保护效果。禽流感对鸡胚有易致病性，易于引起鸡胚的死亡。 

欧洲医药委员会批准的人用流感疫苗，MDCK(犬肾细胞)生产的疫苗，但生产规模有限，目前仅够100万人使用剂量。 

Treanor(2007)用灭活病毒裂解疫苗以90，45，15，7.5ugHA抗原肌肉注射免疫两次，18-64岁451人参与实验。实验结果表明，免疫诱导的抗体反应效果欠佳。 

发明内容

本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的动物禽流感疫苗。本发明的基因工程疫苗，利用家蚕杆状病毒表面展示技术和出芽的特点，产生带囊膜的伪病毒，由于家蚕杆状病毒宿主狭小，无论是在生产和使用上，它都具有比传统疫苗，安全性好，且利用家蚕生物反应器大量表达目的蛋白，生产成本低，产量高，易操作，适用于大规模的生产。 

本发明的技术方案如下： 

本发明提供一种重组基因，由杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽基因序列(SEQ ID NO：7所示)、禽流感病毒主要抗原基因HA序列(SEQ ID NO：8所示)和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域基因序列(SEQ ID NO：9所示)融合而成。 

上述重组基因的制备方法：采用以SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6为引物进行PCR扩增的方法。 

本发明还提供上述重组基因与pBacPAK8质粒重组构建的重组质粒。 

上述重组质粒的制备方法，BamH I和Not I双酶切pBacPAK8质粒和BamH I和NotI双酶切权利要求1所述的重组基因进行重组。 

本发明还提供含有上述重组基因的家蚕重组杆状病毒BmHA，该病毒保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus)，保藏日期为2007年12月28日，保藏编号为CGMCC No.2316。 

上述家蚕重组杆状病毒BmHA的制备方法： 

(1)取权利要求3所述的重组质粒和经Bsu36I酶切的病毒BmBacPAK6的DNA，加入无血清的培养基混匀制成pBacHA混合液； 

(2)取Dosper，加入无血清的培养基，混匀制成Dosper混合液； 

(3)将培养BmN细胞用无血清的培养基洗涤后，逐滴加入上述制备的pBacHA混合液和Dosper混合液，27℃培养； 

(4)收取培养皿中的上清，感染BmN细胞，琼脂糖培养； 

(5)挑取噬斑，分组感染BmN细胞，保存上清； 

(6)感染的BmN细胞DNA用于Southern blot斑点杂交； 

(7)取保存的斑点杂交中阳性克隆细胞的上清进行噬斑筛选； 

(8)取噬斑筛选的阳性克隆细胞的上清感染家蚕细胞。 

本发明还提供上述重组基因表达的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。 

上述蛋白的制备方法： 

(1)将权利要求5所述的家蚕重组杆状病毒BmHA感染BmN细胞进行病毒扩增， 

(2)针刺接种法接入家蚕五龄起蚕和蛹， 

(3)收集表达的权利要求7所述蛋白。 

本发明进一步提供上述家蚕重组杆状病毒BmHA在制备动物禽流感疫苗中的应用。 

本发明还提供上述蛋白在制备动物禽流感疫苗中的应用。 

本发明实现的技术效果如下：