[发明专利]一种霍乱弧菌O139的荧光检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种霍乱弧菌O139的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TCCTGAAATATTGTTGCGTTATAGG-3′

下游引物：5′-ATCCCTATAGATGTAAGCACTTCA-3′

荧光探针：5′-FAM-AAGAAAGATTTGAGATCATTTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括霍乱弧菌O139糖基转移酶基因标准品，所述标准品序列如下：tgtaatgattagaaagaaag ttattgataa atataaaatt aattatgatt taggttataa agatgccgaa gactataaattttgggtcga tttttcaaaa tatacacttt tttctaatgt tcctgaaata ttgttgcgtt ataggtatcatcaagagagt atatcacgtg tagctgataa taaagaaaat aaagaaagat ttgagatcat ttcaaaaattcaaaatgaag tgcttacatc tatagggatt gtattgacaa atgaaggtgc gaaaaatcat ttcattctttcacttaatga gcgcattatt aacaatgtaa cagattgtga tatgataaga gcgcatcttt taaaaataagtagttctcaa attgaaagta gccaatttga ttcttctgct atagaaaggc ttatgttaaa aaaatattttatttatctga ttttatcgat aagaagagat aaagatctga gttatctaaa gatatttgat ttaatgtttttaaaaggtgc ctttttattt ttaaaagata aaatggagca gttttaataa tgacgcttga tatctcagttgttattcctc tatataataa aaactactct attgtaagat gtttgaattc tgttttatat caaactattttgccttttga aataattatt gttaatgacg gttcgactga tgatagtctc gtt。

3.一种霍乱弧菌O139的荧光定量PCR检测方法，所述方法如下：

(1)提取待测样本DNA；

(2)取特异性扩增引物及特异性探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入阴性对照品或待测样品DNA配成PCR反应体系，于同等条件下进行PCR扩增反应，反应管置于定量荧光PCR仪进行荧光检测；

所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TCCTGAAATATTGTTGCGTTATAGG-3′

下游引物：5′-ATCCCTATAGATGTAAGCACTTCA-3′

荧光探针：5′-FAM-AAGAAAGATTTGAGATCATTTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，MGB为荧光淬灭基团；

(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。