[发明专利]一种霍乱弧菌O139的荧光检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种霍乱弧菌O139的荧光检测试剂盒及其检测方法。

(二)背景技术

霍乱是由霍乱弧菌引起的一类以腹泻为主要症状的烈性传染病。过去一直认为只有霍乱弧菌O1型能够致病，而非O1型只能引起轻微的症状，不能导致大规模流行。然而，1992年印度和孟加拉国暴发了一种新型非O1群霍乱弧菌——O139群引起的霍乱大流行。我国近些年在许多地区也不同程度出现霍乱弧菌O139引起的大面积疫情，特别是近几年来，O139群霍乱暴发的比例仍然在不断上升。

霍乱弧菌检测的传统方法主要有形态学、生物化学、凝结试验等，这些检测的周期长，一般在8～10小时以上，对因环境或营养缺乏导致的异形菌株(如L型、球型菌株)则不能检测。一些免疫学方法尽管速度快，但结果不稳定，只能用于疑似病人的快速初筛，还不能作为确诊依据。PCR技术虽然能够快速的对病原菌进行诊断，但是具有大量的假阳性结果存在。研究表明霍乱弧菌O1和O139型在许多基因结构和组成上都是高度相似的；一些毒力因子基因如ctxA和tcpA等均是两种血清型共有的，因此只对于上述的毒力基因进行检测结果是不精确的；而通过比对发现两种血清型霍乱弧菌的糖基转移酶基因(LPSgt)序列存在较大差异。

(三)发明内容

本发明目的是根据霍乱弧菌O139糖基转移酶基因设计引物和TaqMan探针，提供一种检测霍乱弧菌O139的荧光检测试剂盒及其检测方法，可实现对霍乱弧菌O139快速、准确、特异检测。

本发明采用的技术方案是：

一种霍乱弧菌O139的荧光检测试剂盒，所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：

上游引物：5′-TCCTGAAATATTGTTGCGTTATAGG-3′

下游引物：5′-ATCCCTATAGATGTAAGCACTTCA-3′

荧光探针：5′-FAM-AAGAAAGATTTGAGATCATTTC-TAMRA-3′

其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

本发明关键在于特异性引物和荧光探针序列的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择，该试剂盒可用作霍乱弧菌O139的定性检测，也可加入标准品进行定量检测。

为达到定量测定的效果，所述试剂盒还包括可霍乱弧菌O139糖基转移酶基因标准品，所述标准品序列如下：tgtaatgatt agaaagaaag ttattgataaatataaaatt aattatgatt taggttataa agatgccgaa gactataaat tttgggtcga tttttcaaaatatacacttt tttctaatgt tcctgaaata ttgttgcgtt ataggtatca tcaagagagtatatcacgtgtagctgataa taaagaaaat aaagaaagat ttgagatcat ttcaaaaatt caaaatgaag tgcttacatctatagggatt gtattgacaa atgaaggtgc gaaaaatcat ttcattcttt cacttaatga gcgcattattaacaatgtaa cagattgtga tatgataaga gcgcatcttt taaaaataag tagttctcaa attgaaagtagccaatttga ttcttctgct atagaaaggc ttatgttaa aaaaatatttt atttatctga ttttatcgataagaagagat aaagatctga gttatctaaa gatatttgat ttaatgtttt taaaaggtgc ctttttatttttaaaagata aaatggagca gttttaataa tgacgcttga tatctcagtt gttattcctc tatataataaaaactactct attgtaagat gtttgaattc tgttttatat caaactattt tgccttttga aataattattgttaatgacg gttcgactga tgatagtctc gtt。以标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品DNA的拷贝浓度。