[发明专利]固定化基因工程菌生物合成茶氨酸的方法

权利要求书

1.一种固定化基因工程菌，其特征在于通过克隆E.coli DH5α中γ-谷氨酰转肽酶基因构建，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，在中国微生物菌种保藏中心的保藏号为：CGMCC No.2714，保藏日期为：2008年10月16日，所述基因工程菌含有重组质粒pET32a-GGT，质粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，具有氨苄青霉素抗性，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达γ-谷氨酰转肽酶。

2.根据权利要求1所述的一种固定化基因工程菌的生物合成茶氨酸的方法，其特征在于通过以下技术方案实现：

(1)将实施例1提供的工程菌进行发酵培养获得游离细胞，包括以下过程：

1)种子液制备

将冷冻保藏的菌种接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养16小时，使其活化，将活化后的菌种接入盛有LB培养基中，在摇床中37℃，180r/min振荡培养12小时，获得种子液；

2)发酵培养

吸取0.5mL种子发酵液至盛有含有氨苄青霉素的发酵培养基的三角瓶中，37℃，180r/min振荡培养4-6小时，然后加入0.05mmol/L-0.5mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，30℃-32℃诱导4小时，获得含有γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌发酵液；

3)获得基因工程菌游离细胞

将发酵培养所得基因工程菌发酵液8000r/min离心，除去上清液体，并用无菌水洗涤2-3次，获得茶氨酸生物合成基因工程菌游离细胞；

(2)制备固定化细胞的方法

将海藻酸钠配制成10g/L-30g/L的生理盐水溶液，煮沸溶解，冷却至45℃，并与生理盐水调制的该基因工程菌悬液混合均匀后，用注射器注入0.1mol/LCaCl₂溶液中，同时慢速搅拌成形，然后将成形的固定化细胞置于0.03％-0.05％戊二醛溶液中交联30分钟，用0.01mol/L CaCl₂溶液浸泡硬化，静置4-8小时，用去离子水洗涤后滤干备用；

(3)构建的恒温生物合成反应器

反应柱是直径为16mm-32mm，长为100mm-300mm的圆柱形玻璃器皿，通过恒温箱30℃-34℃保温，在填充床反应器中填充固定化基因工程菌细胞颗粒，底物溶液中含有茶氨酸生物合成反应体系，反应体系通过蠕动泵由反应柱上部流入，反应液从反应器下部收集；

(4)连续生物合成茶氨酸的条件

在所构建的生物合成反应器中，填充30g-60g固定化基因工程细胞，以5ml/h-10ml/h的流加速度流加反应体系，30℃-34℃条件下连续合成茶氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)的第2)步中发酵培养基组成为葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、K₂HPO₄ 7.10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄·7H₂O 1g/L。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的反应体系组成为L-谷氨酰胺0.20mol/L—0.40mol/L，盐酸乙胺1.0mol/L—3.0mol/L，pH9.0—10.0。