[发明专利]固定化基因工程菌生物合成茶氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明应用微生物领域，涉及一种固定化基因工程菌细胞连续生物合成茶氨酸的方法。

背景技术

茶氨酸(Theanine)是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一。它是1950年由日本酒户弥二郎从玉露茶新梢中发现的，并命名为茶氨酸(Theanine)。从发现到目前为止，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、红山茶等中检测出微量存在外，在其他植物中尚未发现。茶氨酸还是茶树中含量最高的游离氨基酸，在茶树的新梢芽叶中，70％左右的游离氨基酸是茶氨酸。近年对茶叶保健成分的研究中，茶氨酸是一种比较引人注目的化合物，在它的许多生理作用被发现以后，如何合成及提取茶氨酸也成了广泛关注的研究课题。

茶氨酸属于酰胺类化合物，它的化学名为：N-乙基-γ-L-谷氨酰胺(N-ethyl-γ-L-glutamine)，分子式为：HOOCCHNH₂CH₂CH₂CONHCH₂CH₃，分子量为174.2。自然界存在的茶氨酸均为L型，纯品为白色针状结晶，熔点217-218℃(分解)。[α]D＝+7.0。，极易溶于水，而不溶于无水乙醇和乙醚，且溶解性随温度升高而增大。具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味，味觉阀值0.06％。经6mol/L盐酸水解后生成L-谷氨酸和乙胺，茚三酮反应成紫色。

茶氨酸分子结构为：

茶氨酸自发现以来，一直是被作为茶叶的主要品质成分广为研究。近年来，茶氨酸具有的一些特殊生理功能不断地被发现，从而成为茶叶功能性成分合成和提取、应用的又一大热点，研究表明，茶氨酸具有许多有价值的药用保健功效：

(1)降血压作用；

(2)增强抗肿瘤药物的疗效；

(3)松弛神经紧张、焦虑等作用；

(4)对脑神经细胞保护作用；

(5)促进大脑功能作用；

(6)改善经期综合症作用；

(7)减肥作用；

(8)抗疲劳作用；

(9)提高免疫力，防御病毒；

茶氨酸除了具有以上药用保健功效外，在食品领域也有很好的应用价值，目前，茶氨酸作为食品添加剂已被广泛应用，其安全性和稳定性也得到了肯定。

但由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本还非常昂贵，之前采用茶树愈伤组织、悬浮细胞培养等方法虽然能生成天然L型茶氨酸，但由于运行成本过高，产品制率低，暂时还无法产业化。因此，有关它的合成制备研究越来越受到重视。随着基因工程和发酵工程技术的不断完善和发展，越来越多的基因工程产品相继问世，基因工程菌的发酵工艺是基因工程产品产业化的关键。因此，通过构建基因工程菌生物合成茶氨酸具有广阔的前景和巨大的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化基因工程菌，通过克隆E.coli DH5α中γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)基因，构建了具有茶氨酸生物合成能力的基因工程菌，命名为：大肠埃希氏菌Escherichia coli，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC)，保藏号为：CGMCC No.2714，保藏日期为：2008年10月16日。含有重组质粒pET32a-GGT，质粒大小7563bp，GGT片段大小1743bp，具有Amp(氨苄青霉素)抗性，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导表达γ-谷氨酰转肽酶。

本发明的另一个目的在于提供一种固定化基因工程菌生物合成茶氨酸的方法，通过以下技术方案实现：

(1)将本发明提供的上述工程菌进行发酵培养获得游离细胞，包括以下过程：

1)种子液制备

将冷冻保藏的菌种接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养16小时左右，使其活化。将活化后的菌种接入盛有LB培养基中，在摇床中37℃，180r/min振荡培养12h左右，获得种子液；

2)发酵培养

吸取0.5mL种子发酵液至盛有含有氨苄青霉素的发酵培养基(最优发酵培养基本为葡萄糖10.39g/L、酵母提取物6.88g/L、K₂HPO₄7.10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L、MgSO₄·7H₂O1g/L)的三角瓶中，37℃，180r/min振荡培养4—6小时(OD₆₀₀约0.8)，然后加入0.05mmol/L—0.5mmol/L IPTG，30℃—32℃诱导4小时，获得含有γ-谷氨酰转肽酶的基因工程菌发酵液；