[发明专利]基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流培养方法

权利要求书

1.一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流培养方法，其特征在 于通过以下步骤实现：

I.构建灌流培养装置：通过硅胶软管(5)连接蠕动泵(1)、气体过滤装 置(2)、贮液瓶(3)和样品槽(4)构建灌流培养装置，贮液瓶(3)的出口 端通过硅胶软管(5)与样品槽上槽架(6)进口端相连，贮液瓶(3)进口端 通过硅胶软管(5)与样品槽下槽架(7)出口端相连，贮液瓶(3)设有用于 进行气体交换的过滤装置(2)，样品槽(4)设有通过螺纹(12)卸接的上槽 架(6)和下槽架(7)，上槽架(6)顶部开有培养液进口，下槽架(7)底部 开有培养液出口，下槽架(7)内底部垫有微孔网(9)，支架(8)置于样品槽 (4)内，位于微孔网(9)上方，垫圈(10)位于样品槽内腔(11)顶部；

II.支架/细胞复合物制备：

1)收集培养至第三代的人原代骨髓间充质干细胞：用含10％胎牛血清和 2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养液调节细胞密度至2×10⁶个/ml，以制备细胞 悬液，备用；

2)取经24小时75％酒精消毒的支架，吹干，将吹干的支架放入样品槽下 槽架中，用硅胶软管连接样品槽下槽架的下端出口和无菌注射器，吸取上述约 250μl的细胞悬液，均匀滴至支架上表面，然后以0.05ml/min的流速轻轻抽取 注射器使悬液均匀进入支架内部进行种子细胞接种；

3)接种完毕取出支架放于细胞培养板六孔板中静置2小时，然后每孔加 5ml含10％(v/v)胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的α-MEM 培养液，静态培养24小时，获得支架/细胞复合物；

Ш.低流速灌流培养：

取上述静态培养24小时后获得的支架/细胞复合物，移入样品槽下槽架内， 然后上、下槽架旋转衔接密封样品槽，贮液瓶中加入50ml含10％(v/v)胎牛 血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α-MEM培养液，设定流速 0.2ml/min进行灌流培养11天，每隔三天半量换液；

IV.高流速灌流培养：

上述灌流培养11天后，增加灌流流速至3.0ml/min进行灌流培养21天， 每隔三天半量换液。

2.根据权利要求1所述的一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌 流培养方法，其特征在于：步骤I所述灌流培养装置中的样品槽(4)内径为 10mm，由聚丙烯压模制成，支架(8)直径与样品槽(4)内径相适。

3.根据权利要求1所述的一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌 流培养方法，其特征在于：步骤I所述灌流培养装置中的下槽架(7)材料为 聚乳酸-乙醇酸，直径10mm，厚度3mm，孔隙率94.5％-98.0％，孔径280-450μm。

4.根据权利要求1所述的一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌 流培养方法，其特征在于：步骤I所述过滤装置(2)内置0.22μm的滤膜。