[发明专利]基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流培养方法

说明书

所属技术领域

本发明属生物技术，涉及一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶段灌流 培养方法。这种方法能有效地提高骨髓间充质干细胞在聚乳酸-乙醇酸(PLGA) 支架内种植、扩增和定向分化成骨细胞的能力。

背景技术

骨组织工程为大面积的骨损伤提供了一种替代疗法。体外构建组织工程骨 是骨组织工程的重要研究内容之一，其目的是通过体外扩增种子细胞至一定数 量后，复合到支架材料上进行共培养，形成与骨组织形态学和生物学性状相似 的新生组织来修复骨缺损。

骨髓间充质干细胞是一种理想的骨组织工程种子细胞。体外培养的骨髓间 充质干细胞具有强大的增殖能力，可以扩增10⁹倍；骨髓间充质干细胞在扩增过 程中不会自分化，而且具有多向分化潜能，在一定的条件下可分化为骨，韧带， 脂肪，软骨和肌肉等。鉴于其取材容易、体外扩增能力强、具有多向分化潜能、 植入体内后无免疫排斥，骨髓间充质干细胞被广泛用于与支架材料复合构建组 织工程骨来修复骨缺损。

支架为细胞生长提供三维的结构支架和特异性的生长分化信号，使细胞间 形成适宜的空间分布和细胞连接，形成与体内组织相似的生长微环境。聚乳酸 和聚乙醇酸及其共聚物具有良好的组织相容性、可降解性，且材料表面不影响 细胞的生长和分化，在软骨和骨组织工程应用中显示出较好的性能而被广泛接 受。聚乳酸-乙醇酸(PLGA)支架材料在生物医学和组织工程中得到了广泛应 用。

一个合适的生物反应器系统也为骨组织工程所必需。目前，大体上有三种 主要的生物反应器应用于骨组织工程：转瓶、旋转壁式生物反应器、灌注生物 反应器系统。在转瓶培养系统中，搅动培养液可以增加传质效果，但搅拌在支 架表面产生的剪应力不均会对细胞造成不利的影响；旋转壁式生物反应器提供 了动态培养的环境、低剪应力和高的质传速率，但用于较大块组织培养时，因 为氧气通过分子扩散的方式进行传送，因此只能在支架表面100μm厚度处提供 足够的氧气，支架内部的细胞就无法获得足够的氧气；灌流式生物反应器利用 培养液流经支架材料的孔隙给细胞提供足够的物质输送，同时提供一定的机械 剪应力刺激作用，比较适合大块组织的体外构建。研究表明，对比于静态培养 和其它生物反应器，灌流反应体系可促进细胞的活力和功能，增强成骨分化， 而且使细胞在支架内的分布更均匀。因此，此类反应器常用于培养骨骼组织。

然而，以骨髓间充质干细胞为种子细胞，在灌流培养条件下于PLGA支架 内构建骨组织，涉及到种子细胞在支架内均匀分布、粘附、增殖以及定向分化 成骨细胞等系列过程中培养条件的变化。因此，设计支架内细胞种植、增殖和 定向诱导分化的分阶段灌流培养方法，提高种子细胞在支架内的均匀分布、增 殖效率以及定向分化效果，对体外有效地构建骨组织具有重要的实际应用意 义。

发明内容

本发明于为了有效提高骨髓间充质干细胞在PLGA支架内的种植、分布、 增殖和成骨细胞定向分化效率，提供一种基于骨髓间充质干细胞的骨组织分阶 段灌流培养方法，是基于骨髓间充质干细胞的体外骨组织工程技术。

通过以下步骤实现：

I.构建灌流培养装置：通过硅胶软管连接蠕动泵、气体过滤装置、贮液 瓶和样品槽构建灌流培养装置，贮液瓶的出口端通过硅胶软管与样品槽上槽架 进口端相连，贮液瓶进口端通过硅胶软管与样品槽下槽架出口端相连，形成一 个密闭的循环通道，贮液瓶还设有用于进行气体交换的过滤装置，样品槽设有 可通过螺口卸接的上槽架和下槽架，上槽架顶部开有培养液进口，下槽架底部 开有培养液出口，下槽架内腔底部垫有微孔网，支架置于样品槽内，位于微孔 网上方，O型垫圈9置于样品槽内腔顶部。

步骤I所述灌流培养装置中的样品槽内径为10mm，由聚丙烯压模制成， 支架直径与样品槽内径相适。

步骤I所述灌流培养装置中的支架材料为聚乳酸-乙醇酸，直径10mm，厚 度3mm，孔隙率94.5％-98.0％，孔径280-450μm。

步骤I所述的过滤装置内置0.22μm的滤膜。

II.细胞/支架复合物制备：