[发明专利]表达牛干扰素(α、β或γ－干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

说明书

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达牛干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛α、β或γ-干扰素中的应用。

背景技术

牛干扰素(Bo IFN)基因分为I型和II型，其中I型干扰素又可分为α、β、ω、τ四个类型，均为无内含子的单拷贝或多拷贝基因。干扰素以其广谱的抗病毒活性、抑制细胞分化和增殖及广泛的免疫调节能力决定了其具有巨大的应用潜力，可用来预防和治疗病毒性疾病、寄生虫病等^[1]。随着DNA重组技术的发展，人工大量生产干扰素已成为可能，从而大大降低了干扰素生产成本，增加了利用重组牛干扰素治疗牛病的可能性。牛干扰素的研究始于80年代中期，Velan等(1985)最先以人IFN-α基因为探针从牛的cDNA文库中克隆了牛IFN-α基因，从此广泛展开了对牛IFN生物学功能的研究。20世纪80年代末，随着基因工程技术的发展，重组干扰素被广泛使用。国内外对动物干扰素进行了深入的研究，目前已克隆了猪、狗、鸡等动物的多种干扰素基因，部分重组产品已应用于临床。研究报道体外表达的BoIFN蛋白可以抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感以及非洲猪瘟等病毒的增殖和复制^[2～7]。

大肠杆菌表达系统已广泛用于制备人和动物干扰素，所表达的重组蛋白在体内外具有明显的抗病毒活性^[8～10]。但大肠杆菌表达的蛋白经尿素溶解、变性后复性率低。而且成本高，不便于大规模生产。毕赤酵母和杆状病毒表达系统是近年来发展起来的真核表达系统，表达的外源蛋白可以获得正确折叠和糖基化^[11，12]，但两种表达系统同样存在成本高、纯化困难的缺点。新近发展起来的新城疫活病毒载体系统，使表达的外源蛋白接近天然状态，无需纯化，成本低廉，利于大规模生产有生物活性的外源蛋白。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及重组新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

基于重组牛干扰素在治疗牛病毒性疾病和寄生虫病方面广阔的应用前景，本发明人在已建立的新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建了表达牛α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆，实现了牛α、β、γ干扰素在SPF鸡胚内高效、稳定表达，并对其表达产物进行了抗病毒活性研究。

因此，本发明的一个目的是提供以下各项：

1.一种表达编码牛干扰素的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

2.根据以上1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述牛干扰素是牛α、β或γ-干扰素(优选所述牛α、β或γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述牛α、β或γ-干扰素的基因如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)。

3.根据以上1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rLBoIFN-α，rLBoIFN-β或rLBoIFN-γ。

4.根据以上1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛干扰素中的应用。