[发明专利]通过对生物合成调控基因的遗传操作构建力达霉素高产菌株的方法

说明书

发明领域 

本发明涉及球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)中力达霉素的生物合成基因簇中的调控基因sgcR1，sgcR2，sgcR3(球孢链霉菌C-1027调控基因1，2，3)及由调控基因sgcR1，sgcR2和sgcR3所形成的调控网络。本发明还涉及通过提高基因拷贝数和利用组成型表达的强启动子对正调控基因进行过表达以提高力达霉素产量的方法。本发明还涉及通过这些方法获得的重组菌株。 

背景技术

力达霉素(lidamycin，又名C-1027)是由我国湖北潜江土壤中发现的球孢链霉菌C-1027所产生[1]。力达霉素是迄今为止发现的抗肿瘤活性最强的物质，比临床上常用的阿霉素强10000倍以上[2]。经过十余年的新药研究和开发，目前力达霉素已经进入临床II期研究[3]，有望发展成为具有我国自主知识产权的新型高效的抗肿瘤药物。 

力达霉素属于烯二炔类抗生素，由小分子发色团和辅基蛋白组成，发色团具有环状烯二炔结构，是其对肿瘤细胞具有极强杀伤作用的活性中心。烯二炔类抗生素一般分为九元环(如新制癌菌素(neocarzinostatin，NCS)、maduropeptin(MDP)和力达霉素)和十元环(如calicheamicins、esperamicin和dynemicins)两类。烯二炔类抗生素的作用机制独特，与DNA结合后烯二炔核心重排，导致成环芳构化而形成一个暂时性苯环型的双自由基化合物，不稳定的中间产物促使DNA单链或双链断裂[4，5]。烯二炔类抗生素因其独特的分子结构、极强的抗肿瘤作用和新颖的作用机制在化学、生物学和医学领域均备受瞩目，除力达霉素在我国正在进行临床研究外，1997年新制癌菌素poly(styrene-co-maleic acid)偶联物(商品名SMANCS) 在日本上市[6]，已在日本用于肿瘤临床治疗十余年，而2001年Calicheamicin-CD33抗体偶联物(商品名Mylotarg)成为第一个被FDA批准用于肿瘤治疗的单抗导向药物[7]。力达霉素由于其强烈的生物活性，可以发展为新型高效抗肿瘤药物，也可以作为“弹头”，使导向药物小型化、高效化，其研究和应用展示了广阔的前景。虽然力达霉素的抗肿瘤活性极强，但其发色团结构稳定性差、发酵产量低，不利于规模化生产和导向药物的研发。传统的育种方法虽在一定范围内有效，但定向、理性地构建力达霉素的高产菌株需要对其生物合成机制的深入解析。 

力达霉素生物合成基因簇已得到克隆(GenBank登录号AY048670)。力达霉素生物合成基因簇约75kb，共56个基因。推测其发色团的生物合成过程是首先合成四个结构单元(氨基吡啶糖、β-酪氨酸、氮氧杂萘甲酸和发色团烯二炔核心)，然后再组装在一起[8]。但到目前为止，力达霉素的生物合成机制仅得到初步的解析，研究主要集中在对其生物合成基因簇中生物合成酶的功能解析和生物合成步骤的推定[9，10，11，12，13，14，15，16]，仍有许多细节有待深入研究，尤其是对其生物合成调控机制的研究尚未见报道。 

链霉菌能产生大量的次级代谢产物，在医药和农业生产中具有重要的价值，约70％的已知抗生素是由链霉菌产生的。大多数抗生素生物合成的分子调控往往处于一个复杂的、多级水平的调控网络之中。通常抗生素生物合成的调控主要在三个水平进行：途径特异性(pathway-specific)调控，多效性(pleiotropic)调控和全局性(global)调控[17]。大多数已知的链霉菌抗生素生物合成基因簇中包含有一个途径特异性调控基因，如放线紫红素的途径特异转录激活因子actII-ORF4[18，19]，链霉素途径特异转录激活因子StrR[20，21]等，对所在的抗生素生物合成基因簇中的基因进行特异的、精细的转录调控。随着越来越多的抗生素生物合成基因簇的克隆和测序，发现一些较大的抗生素生物合成基因簇中存在多个途径特异性调控基因，如柔红霉素[22，23，24，25，26，27]、泰乐菌素[28，29，30，31，32，33]、雷帕霉素[34]等。 力达霉素的生物合成基因簇被克隆后，Calicheamicin(AF497482)、新制癌菌素(AY117439)和MDP(AY271660)的生物合成基因簇也陆续获得解析，这3个烯二炔类抗生素的生物合成基因簇中均发现了3个以上的调控基因。