[发明专利]Asial型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法和应用有效

专利信息
申请号: 200810171258.2 申请日: 2008-10-30
公开(公告)号: CN101724636A 公开(公告)日: 2010-06-09
发明(设计)人: 于力;王海伟;杨德成;涂亚斌;周国辉 申请(专利权)人: 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
主分类号: C12N15/42 分类号: C12N15/42;C12N15/79;C12N7/00
代理公司: 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司 11139 代理人: 孙皓晨;费碧华
地址: 150001 黑龙*** 国省代码: 黑龙江;23
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摘要:
搜索关键词: asial 口蹄疫病毒 感染性 cdna 及其 构建 方法 应用
【说明书】:

技术领域

本发明涉及单股正链RNA病毒的感染性克隆,尤其涉及Asia1型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法,本发明还涉及由该Asia1型口蹄疫病毒感染性cDNA和表达T7RNA聚合酶的真核表达载体所组成的江苏谱系Asia1型口蹄疫病毒的反向遗传操作系统;本发明还进一步涉及该感染性cDNA通过体外转录以及该反向遗传操作系统通过体内转录的方式在拯救口蹄疫病毒中的应用,属于基因工程领域。 

背景技术

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员,为单股正链RNA,其基因组RNA全长约8.5kb。口蹄疫是严重危害偶蹄动物的重要传染病之一,该病引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低,导致巨大的经济损失。此外,由于贸易的限制和禁止而引起的损失更大,全世界每年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元。2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发了Asia1型FMD(Asia1/JS/CHA/05,GenBank登录号:EF149009),由于在我国江苏省首先分离,被称作Asia1型江苏谱系。该谱系口蹄疫病毒在我国 牛群中一经流行,传播趋势迅猛,造成的损失极为严重。因此,积极开展Asia1型FMD江苏谱系毒株的研究,对我国FMD的防控具有重要的意义。 

反向遗传操作系统是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通过对病毒基因组进行定点突变、缺失、替换基因组的任意部分以产生突变体,借此在分子水平上研究病毒基因的结构与功能、了解决定病毒毒力的分子基础、宿主嗜性与跨种传播的机制。感染性克隆还可用于抗原表位的研究,特别是构象表位的研究。为研究病毒减毒奠定了实验基础,为研制新型疫苗提供了有力的工具。 

目前已经有报道成功构建了牛源毒株01K株(Zibert A,Maass G,Strebel K,et al.Infectious foot-and-mouth disease viruses derived from acloned full-length cDNA[J].J Virol,1990,64:2467-2473)、牛源毒株A12株(Rieder E,Bunch T,Brown F,et al.Genetically engineeredfoot-and-mouth disease viruses with poly(C)tracts of two nucleotide arevirulent in mice[J].J Virol,1993,67:5139-5145)、猪源毒株OH/99株(Guanqing liu,et al.Generation of an infectious cDNA clone of anFMDV strain isolated from swine.Virus Research,2004,104:157-164)以及兔化弱毒疫苗株ZB/CHA/58(att)(中国专利公开号:CN101225395A,发明名称:亚洲一型口蹄疫病毒感染性cDNA及其构建方法。)口蹄疫病毒的感染性cDNA,并在此基础上对FMDV进行了探索性的研究。但上述感染性克隆与我国近年来流行的江苏谱系Asia1型口蹄疫病毒有着很大的遗传偏离,因此构建符合我国流行情 况的江苏谱系Asia1型口蹄疫病毒的反向遗传操作平台,对开展Asia1型口蹄疫病毒结构与功能研究以及新型疫苗的研制具有重要的意义。 

发明内容

本发明的首要目的是提供一种Asia1型江苏谱系口蹄疫病毒的全长感染性cDNA,该全长感染性cDNA包含了保证所合成的转录本具有感染性所要求的poIy(A)序列和poIy(C)序列; 

所述Asia1型口蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆5’末端具有T7RNA聚合酶启动子序列,3’末端具有单一的限制性酶切位点;其中,所述的3’末端限制性酶切位点是EcoRV酶切位点或NotI酶切位点;5’末端上游具有SphI酶切位点。 

所述Asia1型口蹄疫病毒的全长感染性cDNA克隆除了启动子,poIy(A)序列和poIy(C)序列之外,其余的核苷酸序列与口蹄疫病毒基因组天然序列相差不超过6个核苷酸序列; 

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