[发明专利]抗牛成熟叠朊蛋白的单克隆抗体mab-bomDpl-9及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及采用基因工程制备一种单克隆抗体(以下简称为单抗)及其制备方法和用途，确切讲是用基因工程制备的抗牛成熟叠朊蛋白(matureDpl，mDpl)的单抗mab-bomDpl-9，以及这种单抗的制备方法和用途。

背景技术

叠朊蛋白(Dopple，Dpl)是细胞型朊蛋白PrP^C的一种“横向同源物”，与疯牛病等海绵状脑病的发生有一定的关系，但是目前除了能够确定它与雄性的生殖功能有关以及过量表达具有神经毒性作用外，还不清楚其它的生理功能。抗体，尤其单抗是研究蛋白质结构与功能的有效工具。所以，制备针对Dpl的单抗具有重要意义。

Dpl是由Prnd基因编码的约由179个左右氨基酸残基组成的糖蛋白，也是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白，其前体形式是由氨基端的信号肽(牛Dpl信号肽为1-26位氨基酸残基)、中间的mDpl(牛mDpl为从第27位至第155位氨基酸残基组成)和羧基端的GPI结合区(牛Dpl该区从第156位至第179位氨基酸残基组成)组成。编码Dpl的开放阅读框(ORF)位于一个单一的外显子内，其编码的Dpl前体在蛋白质的翻译后修饰过程中切除了氨基端信号肽和羧基端GPI结合区的氨基酸残基，添加上GPI锚，形成mDpl。Dpl主要分布在睾丸组织中，由于直接制备来源于牛睾丸组织的Dpl，不仅受材料限制，而且获得的量很少，不易纯化。所以，以牛睾丸组织为实验材料不利于免疫原制备。

在抗牛Dpl的单抗制备方面，国外学者制备出了系列的针对本土牛Dpl的单抗，应用于Dpl的免疫印迹(Western Blotting)和免疫组化等方面。研究表明，中国黄牛Dpl的编码基因BoPrnd(在GenBank中的登录号为DQ408532)的ORF为537bp，与Genbank登录的国外其它牛Prnd的ORF的最高同源性为99％(534/537)，例如DQ205538，NM174158和BTA 278011序列，分别在第149、395和438位发生G→A，G→A和C→G的改变，相应地引起氨基酸发生了R(精氨酸)50H(组氨酸)，H(组氨酸)146Q(谷氨酰胺)的改变。发生改变的这两个氨基酸位于牛mDpl内，这表明中国黄牛mDpl的氨基酸序列不同于国外本土牛的mDpl氨基酸序列。所以，采用基因重组技术制备大肠杆菌表达的牛mDpl，代替从牛睾丸组织中提取的mDpl，以此为免疫原，获取针对中国黄牛mDpl的单抗，对研究中国黄牛mDpl的结构与功能具有重要意义。此单抗能够为研究工作提供有力实验工具，有助于进一步阐明疯牛病的发病机制。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗中国黄牛成熟叠朊蛋白mDpl的单抗bomDpl-9，同时给出单抗bomDpl-9的轻链和重链可变区编码基因；本发明的目的之二是提供单抗bomDpl-9的一种制备方法；本发明的目的之三是提供单抗bomDpl-9的用途。

本发明所涉及的抗中国黄牛成熟叠朊蛋白mDpl的单抗bomDpl-9被命名为：“mab-bomDpl-9”，其轻链可变区基因见后附的序列表<400>1，其重链可变区基因见后附的序列表<400>2。

Mab-bomDpl-9的制备方法如下：以纯化的大肠杆菌表达的重组型中国黄牛mDpl为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞株，在鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，收集腹水进行亲和层析纯化，得到抗牛mDpl的单抗。

本发明的mab-bomDpl-9的制备方法中还可以是下述方法：在制备以大肠杆菌表达的重组型中国黄牛mDpl为免疫原的过程中，采用了含有中国黄牛mDpl编码基因的重组表达质粒pET30a(+)-bomDpl和含有该重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的表达菌株pET30a(+)-bomDpl-BL21(DE3)，并以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达菌株，表达重组牛mDpl，收集包涵体后，采用亲和层析法和切胶后的电洗脱法纯化重组蛋白，以纯化后的重组牛mDpl为免疫原，免疫Balb/C小鼠，取免疫鼠脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用间接ELISA方法筛选融合的杂交瘤细胞株，再用有限稀释法克隆筛选的阳性杂交瘤细胞株，获得了能够稳定分泌抗重组牛mDpl的阳性杂交瘤细胞株----csbomDpl-9，在鼠体内接种杂交瘤细胞csbomDpl-9，生产腹水抗体，抽取腹水，离心收集上清液，以葡萄球菌蛋白A亲和纯化，得到抗牛mDpl的mab-bomDpl-9。