[发明专利]利用农杆菌提高大蒜的转化效率的方法及由其制备的大蒜

说明书

【技术领域】

本发明涉及利用农杆菌提高大蒜植物体的转化效率的方法以及由该方 法制备的大蒜植物体。

【背景技术】

大蒜与洋葱及葱同为百合科作物，在经过漫长的栽培以及体细胞突变 后，在全世界范围内选择性地分化为多个地域种(Pooler，M.R.and P.W.Simon. 1993.Euphytica 68：121-130)。但其遗传变异非常有限。特别是由于不能有性 繁殖，因此不能通过基因重组和杂交来培育品种。再者，作为营养繁殖作物， 大蒜因感染病毒数量骤降，根据报道，因感染OYDV而减少的大蒜数量达 到36-60％(Lot et al.，1994.Plant Pathol.43：537-546)。大蒜栽培中存在的问 题之一是，除草费功夫，并且在高温期没有适当的除草剂。为了开发大蒜的 培育方法、挖掘大蒜的功能性基因，需要开发转化的方法。为了成功地进行 转化需要开发出将外部基因导入葱属植物的基因组的详细方法。根据报道， 葱属植物转化困难，葱属植物的转化中最常用的方法是利用根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)和基因枪法。Dommisse等(Dommisse et al.， 1990.Plant Science 69：249-257)利用根癌农杆菌(11种)、悬钩子土壤杆菌 (A.rubi)(1种)、发根土壤杆菌(A.rhizogenes)(6种)从洋葱中确认了根瘤 反应和冠瘦瘤生产，因此提示了转化的可能性。最近Eady(Eady，C.C.1995. New Zealand J.of Crop and Horticultural Science 23：239-250，Eady et al.，2000. Plant Cell Rep.19：376-381)和Zheng(Zheng et al.，2001.Molecular Breeding7，101-115)确认了利用农杆菌在洋葱的合子胚和未成熟胚上进行转 化，并且gusA基因可以稳定表达，而Zheng利用坟丘形洋葱即冬葱(shallot) 实现了1.95％的转化率。报道转化大蒜的事例已有三件：kondo等(Kondo T，H. Hasegawa，and M.Suzuki.2000.Plant Cell Rep.19(10)：989-993)对从原生质 体中诱导出的愈伤组织进行农杆菌的转化，确认了gusA的表达；Park等(Park， M.Y.2000.PhD Diss.，Seoul National University)利用基因枪法导入了对除草 剂具有抗性的乙酸乳酸合成酶基因；Zheng等(Zheng et al.，2001.Molecular Breeding7，101-115)利用根癌农杆菌导入BT抗性基因，但是转化效率不高。 到现在为止，已开发的除草剂抗性基因有bar、aroA、bxn(Powles et al.，1997. In:sparks DL(ed)Adv Agron 58：57-93)基因。目前，已从吸水链霉菌 (Streptomyceshygroscopicus)中分离出对除草剂具有抗性的bar基因，并用 于开发(Thompson et al.，1987EMBO J.6(9)：25：2516-2523)除草剂抗性作物。 据报道，在世界范围内用于商业目的的抗除草剂作物有大豆、玉米、棉花、 油菜等，占世界转化作物栽培面积(1亿200万公顷)的68％(James C.2006. ISAAA briefs35-2006.www.isaaa.org)，且以后还会急剧增加。

【发明内容】

本发明是为了满足上述的要求而提出的。本发明的目的是利用农杆菌提 高大蒜的转化效率，因此在诱导愈伤组织的培养基的组分和农杆菌和大蒜愈 伤组织共同培养时间及培养基的组分以及再分化培养基组分不同的情况下， 以研究大蒜转化效率的高低。

为了解决上述课题，本发明提供了提加大蒜的转化效率的方法以及用这 种方法再生的大蒜植物体。具体方法如下：

(1)在添加有0.5-2mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和0.05-0.3mg/L 的吲哚基乙酸(IAA)的MS培养基上培养7-9周，以诱导产生愈伤组织的 阶段；