[发明专利]一种纳米壳聚糖衍生物,其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学纳米材料技术领域。具体而言，本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物，其制备方法以及利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性和特异性富集和纯化磷酸化多肽的方法。 

背景技术

翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中研究的热点课题。蛋白质的磷酸化是最常见的、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，人类基因所编码的蛋白质中，约有30％的蛋白质可进行磷酸化，蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等，蛋白质磷酸化还是主要的信号传递方式。 

蛋白质磷酸化分析的传统方法如放射性同位素标记，Edman降解，凝胶电泳和色谱分析等方法。这些方法操作繁琐，需要高超的实验技巧和较多的蛋白质，而且存在潜在的放射性危险。质谱技术已经发展成为鉴定磷酸化蛋白的重要工具之一。 

质谱在鉴定磷酸化蛋白时，仍面临巨大的挑战，其具体体现是：第一，磷酸化蛋白在细胞内所有蛋白中为低丰度；第二，磷酸化多肽的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量非磷酸化肽的质谱信号通常会淹没磷酸化多肽的离子信号。因此，直接用质谱分析复杂蛋白酶解产物中的磷酸化多肽是非常困难的，一般要求将磷酸化多肽纯化后再用质谱分析。 

磷酸化多肽的富集使用最多的是固定化金属亲和螯合色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。在这种技术中，一般采用将螯合剂亚胺基二乙酸键合在色谱基质上，然后利用螯合作用将Fe³⁺、Ga³⁺等金属离子固定在色谱基质上。由于磷酸化多肽中的磷酸基团与固定化的Fe³⁺等金属离子的相互作用而保留在色谱基质上获得分离。这种方法的缺点是特异性不强，一些酸性非磷酸化肽也会被富集起来，从而干扰对磷酸化肽的检测。虽然这种技术取得了很大的进展，但是用于大规模地富集磷酸化多肽仍需提高其选择性和有效性，解决的方法包含如下两方面：1)、优化富集磷酸化多肽的过程，包括：吸附，洗涤，和洗脱来选择性地富集磷酸化多肽。2)、优化进行IMAC的亲和基质，包括：选择不同的过渡金属，亲和官能团和固载基质。现已用的固载基质有琼酯糖，葡聚糖，硅胶和合成的聚合物衍生物如纤维素，聚(苯乙烯/二乙烯基苯基)，聚(羟基/甲基丙烯酸)等。壳聚糖(Chitosan)又称可溶性甲壳质、甲壳胺、几丁聚糖等，化学名为2-氨基-β-1，4-葡聚糖，它是甲壳素经脱乙酰基而得到的一种天然阳离子多糖，具有可降解性、良好的成膜性、良好的生物相容性及一定的抗菌和抗肿瘤等优异性能，广泛应用于医药、食品、化工、环保等行业，素有万能多糖的美誉(R.Jayakumar et al.CarbohydratePolymers 62(2005)142-158)。甲壳素在自然界分布非常广，是一种廉价易得的原料。但是未见用壳聚糖衍生物作为固载基质来富集和纯化磷酸化多肽的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种纳米壳聚糖衍生物，其制备方法，以及利用该纳米壳聚糖衍生物高选择性、特异性的富集和纯化磷酸化多肽的方法。 

本发明提供一种纳米壳聚糖衍生物，其特征在于颗粒大小为1-300nm，优选为20-100nm，以及固载基质为壳聚糖。在一个实施方案中，该衍生物带有活性环氧基团(中间体1)，所述活性环氧基团选  自取代或未取代的丙烯酸环氧丙酯或取代或未取代的丙炔酸环氧丙酯，其中取代基为C₁～C₁₀直链或支链烷基，C₁～C₁₀直链或支链烷氧基，C₁～C₁₀直链或支链烯基，C₁～C₁₀直链或支链炔基，或卤素，优选选自甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯。在另一实施方案中，该衍生物带有活性羧基官能团(中间体2)，任选进一步与过渡金属离子络合，其中活性羧基官能团选自亚胺基二乙酸或氨基三乙酸或乙二胺三乙酸，过渡金属离子选自Fe³⁺，Ti⁴⁺，Ni²⁺，Zr⁴⁺或Ga³⁺。