[发明专利]稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞。

背景技术

人胚胎干细胞具有自我复制及多潜能分化的特性，理论上可以分化为机体任何细胞，例如：心肌细胞，胰腺β细胞，多巴胺能神经元等，为临床细胞移植提供了丰富的细胞来源。但是人胚胎干细胞分化细胞在移植过程中面临着免疫排斥的重大问题。HLA-G属于非经典HLA-I类基因(HLA-Ib)，有7种亚型，其中4种为膜结合型(HLA-G1、G2、G3、G4)和3种可溶型(HLA-G5、G6、G7)，主要分布在母体胎儿界面绒毛外细胞滋养细胞，在母胎免疫耐受及器官移植方面具有重要的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，解决人胚胎干细胞分化细胞在移植过程中面临着免疫排斥的重大问题。

本发明提供的技术方案是：一种稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞分化细胞，其特征在于由下述方法得到：

一、构建HLA-G的慢病毒真核表达载体，步骤如下：

1)获取胎盘组织cDNA；

2)设计引物，PCR扩增获得HLA-G序列并回收；

3)将其连接T-easy质粒，酶切，其中上游XbaI内切酶，下游BsrGI内切酶，测序鉴定，测序结果如SEQ ID No.3所述；

4)将扩增获得的HLA-G与慢病毒载体质粒连接；

5)在293T细胞中包装慢病毒；

二、建立稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞并检测其全能性

三、诱导稳定表达HLA-G分子的人胚胎干细胞随机及定向分化细胞，检测这些分化细胞HLA-G分子的表达。

上述第2)步中，所述引物序列是：上游引物序列如SEQ ID No.1所述，下游引物序列如SEQ ID No.2所述。

上述第5)步中，慢病毒包装过程如下：

1)转染时三种质粒的比例：DB∶CMVΔ∶PMDG＝3∶4∶1；

2)包装细胞为293T；

3)转染前24小时，293T细胞传代；

4)按如下步骤操作：(以100mm的培养皿为例)

a)1.5ml的无血清Opti-MEM稀释60ul Lipo2000，混匀，RT，放置5分钟；

b)1.5ml的无血清Opti-MEM稀释24ug质粒，混匀

c)将上述稀释液混合、混匀、RT、放置20分钟

5)将3ml混合液加入含有适量培养基的293T细胞的培养皿中；

6)37℃、5％CO2培养箱培养8h，换液(预热)，并开始计时；

7)24h及48h分别收集培养液，4℃避光保存；

8)2000rpm离心5min，取上清约1ml，加入K562或直293T细胞中，同时加2ul；Polybrene(4ug/ul)，2小时后补加1ml新鲜培养液，24-48h观察细胞是否出现绿色荧光；

9)0.45ul滤器(Milipore公司)过滤收集的培养上清液

10)采用柱子(Milipore公司，Amicon Ultra-15centrifugal Filter Devices货号：UFC910096)，4000g，30分钟；

11)收集病毒浓缩液，滴度测定，分装，-80℃保存。

上述第二步中，慢病毒转染人胚胎干细胞建立稳定表达HLA-G分子的过程是：

(1)胶原酶IV消化人胚胎干细胞；

(2)PBS洗2遍；

(3)加入2ml培养液将人胚胎干细胞重悬；

(4)同时加入60ul病毒液及8ul Polybrene(5mg/ml)；

(5)2小时后离心，PBS洗2遍，去除病毒

(6)将人胚胎干细胞重新种植于饲养层细胞上，72小时后加入50ug/ml潮霉素B筛选，获得稳定表达HLA-G的人胚胎干细胞。

本发明的具有如下优点：本发明采用慢病毒转染系统对人胚胎干细胞进行基因修饰。对于人胚胎干细胞进行基因修饰目前最好的技术手段就是慢病毒转染系统。该系统的优点是：以HIV-1为基础构建的慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，是目前理想的基因转移载体。本发明人设计了将具有免疫耐受作用的HLA-G分子稳定转染人胚胎干细胞，并使其分化细胞依然表达HLA-G分子。本发明对于解决临床将人胚胎干细胞定向分化细胞进行移植时的免疫排斥问题奠定基础，具有深远的临床应用价值。

具体实施方式