[发明专利]阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种选育的领域，尤其是采用重离子12C+6辐照诱变。

背景技术

优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。目前常用的发酵微生物菌种选育技术，一种是常规的诱变育种方法，另一种是分子育种方法。常规的诱变育种方法采用物理诱变因子如紫外线等进行诱变育种，或者采用化学诱变因子如硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍、氯化锂、香豆素等进行诱变育种，或者采用物理因子和化学因子的复合诱变育种。常规育种具有盲目性强，工作量大、成功率低，而且现有的生产菌种对以往常用的物理和化学方法均表现出不同的抗性。分子育种方法是采用原生质体融合技术和DNA重组技术等一系方法选育菌种，该方法操作难度大，而且由于发酵工业生产规模大，基因工程菌经反扩大培养很容易引起质粒失活甚至丢失，造成基因表达困难。因此寻找新的诱变育种方法是迫切要解决的问题。

阿维菌素是当今最受关注的生物杀虫杀螨剂之一，是被推荐使用的高效低毒农药，阿维菌素(Avermectin)是由阿佛曼链霉素经液体发酵加工而成，与传统农、兽药相比，具有高效、广谱、剂量小、适口性好、有效期长、不易产生抗药性，易降解，无残留等特点，且不易产生耐药性，与其他杀虫药无交叉抗性。在土壤降解快、光解迅速。对作物安全，不易产生药害。目前：影响其发展的主要原因为：作为菌种的阿佛曼链霉菌发酵效价提升缓慢，甚至长期得不到突破性进展。

天然阿维菌素中含有8个组分，主要有4种即A1a、A2a、B1a和B2a，其总含量≥80％；对应的4个比例较小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其总含量≤20％。目前市售阿维菌素农药是以abamectin为主要杀虫成分(AvermectinB1a+B1b，其中B1a不低于90％、B1b不超过5％)，以B1a的含量来标定。

AVMB1a分子式：C₄₈H₇₂O₁₄(R＝C₂H₅)

AVMB1a分子量：872

阿维菌素为白色或淡黄色结晶物，熔点为157-162℃，α(CHCl3)＝+55.7在237、245、254nm处均有吸收峰，λmax＝244±2nm，阿维菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶剂，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度极低(10μg/l)，本品应在干燥、密闭、阴凉遮光下保存。分子中无酸性或碱性官能团，在一般条件下稳定，在PH5-9时不会水解，无腐蚀性，对环境安全。

阿佛曼链霉菌菌种的选育时，经紫外线和亚硝基胍反复处理，菌种的发酵效价得到了显著的提高，从野生菌种发酵效价的10微克/毫升提高到了目前的4000微克/毫升，但是再提高已经非常困难，严重影响了生产规模，生产成本居高不下。业内人士目前面临的主要问题是寻求一种能提高菌种选育技术水平的好方法，以便得到一种对阿维菌素深层培养的高产优质菌种和达到大幅度降低生产成本的目的。

发明内容

本发明的目的为提供一种正突变变率高，发酵效价高、诱变条件可控可调可多次重复的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法。

菌种的中能重离子束辐照诱变是一种新近发现的独特的物理诱变方法，因为重离子束具有参数多样，LET大，RBE高等特性，利用它可提高突变率，拓宽突变谱，缩短育种周期，是近年来辐射育种的一种新方法。

实现上述发明目的的技术方案为阿佛曼链霉素菌种用¹²C⁺⁶重离子束辐照进行诱变，辐照剂量范围为40-70Gy，优选剂量为50Gy。

阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法的具体步骤：

(1)阿佛曼链霉素菌种孢子悬液用¹²C⁺⁶重离子束辐照进行诱变；

(2)将辐照诱变后的孢子悬液和出发菌种的孢子悬液分别进行梯度稀释，用生理盐水稀释至10^-4-10^-5倍；

(3)将稀释的悬液准确转到分离平板培养基上，涂抹均匀，分离单个菌落，测定最佳正突变率最佳诱变剂量；

(4)对突变明显的菌落，用接种环取菌落孢子接种在斜面培养基上；

(5)将(3)的平板培养基与(4)的斜面培养基包扎后置于28℃恒温箱中培养6天，再置于2-4℃冰箱中等待菌种接种；