[发明专利]一种发酵生产环孢菌素A的方法

权利要求书

1.一种利用多孔木霉(Tolypocladium inflatum csp3)发酵生产环孢菌素A的方法，其特征在于，包括种子培养基和发酵培养基的制备以及利用该菌株进行的发酵培养，其工艺如下：

(1)摇瓶种子液培养：

将4℃冰箱保存的新鲜斜面用无菌水充分洗刷，而后将斜面孢子液接种至摇瓶培养基，进行培养；

培养基成分和含量为果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L；

(2)种子培养：

按体积百分比，将(1)中生长好的种子按接种量1-2％的比例接种种子罐进行培养；

培养基成分和含量为果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L，消泡剂1-4g/L；

所说的菌种为多孔木霉(Tolypocladium inflatum csp3)；

(3)发酵培养：

按体积百分比，将(2)中培养好的种子按接种量5-15％的比例移种至发酵罐培养；

培养基成分和含量为葡萄糖50-200g/L，磷酸氢二铵3-10g/L，L-Valine 1-10g/L，NaNO₃ 1-5g/L，KCl 0.1-0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，ZnSO₄·7H₂O0.0001-0.0005g/L，MnCl₂·4H₂O 0.00005-0.0001g/L，消泡剂5-10g/L；

90小时前pH控制在4.0-6.0，之后放弃pH的调控，在目的产物进行分泌阶段，进行补料控制，于200-260小时下罐；

(4)采用常规方法，从发酵培养产物中收集环孢菌素A。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，斜面培养时pH 4.0-6.0，搅拌转速250rpm，温度25-30℃，湿度40％-60％条件下振荡培养30-50小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，种子培养时pH 4.0-6.0，温度25-30℃，搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa，培养30-50小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养时pH 4.0-6.0，温度25-30℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中90小时之前，发酵液的pH通过流加氨水的方式进行调控。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中补料控制所流加的营养物质为葡萄糖和磷酸氢二铵溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中在目的产物分泌阶段(120小时之后)，发酵液中葡萄糖浓度维持在10-20g/L，氨基氮浓度维持在300-1000mg/L，若低于此浓度，则进行补料控制。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中补料的葡萄糖溶液浓度在0.5-1.2g/L，磷酸氢二铵溶液浓度在400-450mg/L。