[发明专利]一种发酵生产环孢菌素A的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种发酵生产环孢菌素A的新方法。

背景技术

环孢菌素是一种主要用于器官移植领域的免疫抑制剂，它是一种由真菌产生的环状寡肽，其结构式如下：

环孢菌素除了有环孢菌素A外还有B、C、D、U、L等20多种化合物，可以用字母A-Z来表示。在瑞士专利CH589716和CH603790中最早报道了环孢菌素的发酵生产。在所有的环孢菌素当中，环孢菌素A是首先从真菌培养物中分离出来的，后来发现其具有很强的免疫抑制活性。

环孢菌素A首先由瑞士山道士公司于1970年从微生物代谢产物中分离获得，1978年首次用于临床肾移植试验，美国FDA于1983年批准其可以用于临床器官的移植，它是第一个具有真正选择性的免疫抑制剂，开辟了脏器移植的新纪元。其详细的资料在ProcessBiochemistry 1991，26：157～166文献中已经有公开的报道。

目前在器官移植领域，环孢菌素仍然是最基本的免疫抑制用药。除肝脏移植治疗可以用FK506替代外，其他领域都很难被替代，作为一种免疫抑制剂，环孢菌素A的主要特点是抑制作用选择性，即主要抑制T细胞的增殖与分化。环孢菌素A抑制T细胞的活化，抑制Th产生白细胞介素-2和白细胞介素-3，以及β干扰素等各种淋巴因子和白细胞介素-2受体的表达，从而抑制了细胞毒T细胞的产生。在药理剂量下，环孢菌素A对抑制性T细胞的产生没有抑制作用，这一点对抑制耐受性的形成很有意义。环孢菌素A对B细胞和巨噬细胞的增殖和功能没有直接的抑制作用。这些特点是以前任何免疫抑制剂所没有的。从而使免疫抑制剂的研究和应用进入了一个新的被称之为环孢菌素时代。

环孢菌素A除了用于器官移植领域外，还可以用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牛皮癣、再生障碍性贫血、皮肤肌炎以及肾综合症的治疗等。

目前国内外实现了环孢菌素的工业化生产，主要是通过微生物菌种发酵产生，工业应用比较多的微生物有光泽柱孢菌(Cylindrocarpon lucidum)、多孔木霉(Tolypocladium inflatumcsp3)、镰刀孢霉等，但是发酵水平普遍不高，CN1570130A专利中提到的新工艺其发酵效价只有2.023g/L，导致后续提取成本升高，势必增加患者的用药负担。因此提供一种新的制备环孢菌素A的方法是非常需要的。

发明内容

本发明提供了一种发酵生产环孢菌素A的新的培养基及其发酵控制工艺，克服了现有生产技术的不足，提高了环孢菌素A的产量，从而为工业化生产提供了一种新的生产工艺。

本发明共涉及三方面的内容，即摇瓶种子液的制备、种子罐的培养和发酵培养。

(1)摇瓶种子培养：

将4℃冰箱保存的新鲜斜面用无菌水充分洗刷，而后将斜面孢子接种摇瓶培养基，于250rpm、温度25-30℃、湿度40％-60％条件下振荡培养30-50小时；

培养基成分和含量：果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L，pH 4.0-6.0；

(2)种子培养：

将(1)中生长好的菌种按接种量1-2％的比例接种种子罐(体积百分比)进行培养，培养条件：温度25-30℃，搅拌转速250rpm-450rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa，培养30-50小时；

培养基成分和含量：果糖2-15g/L，葡萄糖5-25g/L，豆粉5-25g/L，玉米浆粉2-10g/L，；pH 4.0-6.0；

所说的菌种为多孔木霉(Tolypocladium inflatum csp3)，

(3)发酵培养：

将(2)中培养好的种子按接种量5-15％的比例移种发酵罐，在温度25-30℃，搅拌转速250rpm-550rpm，通气量0.5-1vvm，罐压0.04-0.07Mpa下培养，90小时前pH控在4.0-6.0，之后放弃调控，中间进行补料控制，于200-260小时下罐；