[发明专利]用于寡核苷酸微阵列的定量方法

说明书

发明领域

本发明涉及核酸定量测量的系统和方法，尤其是涉及实时、同时定量分析 来自一种或多种病原体的多种核酸的系统和方法。

发明背景

核酸的定量分析在基础生物学研究和诸如临床微生物领域中非常重要。定 量分析典型地在两个阶段完成。首先将样品中的靶核酸扩增以产生可检测量的 核酸供定量工具应用。将检测到的靶核酸的量用于计算最初存在于样品中的核 酸量。

聚合酶链式反应(PCR)是扩增核酸，尤其是脱氧核糖核酸(DNA)的有力方 法。实践PCR的关键是应用耐热的DNA聚合酶，即能够催化DNA复制且在 用于将DNA螺旋分离为两条核酸单链的升高温度下不会变性的蛋白。

通过将靶标双链DNA置于提供有与靶标DNA互补的小序列单链DNA(称 为引物)和耐热DNA聚合酶的核苷酸缓冲液中启动PCR。通过将混合物的温度 循环通过三个阶段，能够指数地扩增靶标DNA。第一阶段是高温(94℃)变性 阶段，其中将双链DNA分离为两条单链。第二阶段是低温(60℃)退火阶段， 其中引物结合至单链DNA。最后，延伸阶段发生在中间温度(72-78℃)。在延 伸阶段，DNA聚合酶催化退火至靶标DNA的引物地延伸，添加合适的核苷酸 直到形成完整的双链DNA螺旋。在每一个PCR循环中，靶标DNA的拷贝数 大约翻番了，使得靶标DNA快速积累。

原则上，在PCR循环系列终点所产生的靶标DNA的量(也称为“终产物”) 与在最初样品中靶标DNA的拷贝数成比例。然而，实际上，扩增的指数性质、 启始扩增的引物退火的细微差别导致了饱和及其它影响，使得PCR终产物是最 初样品中靶标DNA量的非常不可靠的估计。

在90年代中期发展了实时聚合酶链式反应(实时PCR)方法，以改进最初的 PCR方法，避免了这些困难，提供了样品中任意靶标DNA拷贝数的可靠、精 确的测量。在实时PCR中，将只有当结合至靶标DNA才会有活性的荧光探针 加入到PCR缓冲溶液中。这些荧光探针是单链DNA，其中间部分具有与靶标 DNA互补的核苷酸序列。在这一中间部分的任一侧是与彼此互补的延伸核苷酸 序列，因此，没有结合的探针将自己折叠为发夹结构。荧光探针在一端具有荧 光分子，以及在另一端具有荧光淬灭分子。未结合的，折叠的探针具有彼此相 邻的发荧光和淬灭分子，并且因此当照射未结合的探针时不会发射出荧光。然 而，当荧光探针结合至其靶标DNA时，其是展开的，发荧光和淬灭分子彼此分 离。当用合适波长的光照射结合的探针时，荧光分子发射出荧光。

通过为特定靶标DNA提供足够的荧光探针，并且在PCR的每一个阶段测 量来自结合探针的荧光，可以测量每一个反应阶段扩增子的数量。这一方法可 以用于非常精确地确定最初样品中DNA的拷贝数，因为使扩增子数目达到预先 确定的阈值的部分循环数与最初样本中拷贝数的对数之间是线性关系。

这样，可以用实时PCR来确定样品中靶标DNA的量，在超过9个数量级 的范围具有少于2％的误差，即其可以计数最初样本中少至5，以及多达50亿 条靶标DNA拷贝。

然而，实时PCR技术具有局限性，其最显著的是实时PCR只能在一个反应 管中测量小数量的核酸，因为具有合适的相应荧光发射光源的合适的荧光染料 数量是有限的。

对于许多应用来说，同时量化一种以上种类的核酸是非常期望的。需要的 是允许用实时PCR应用小数量的荧光染料，以及优选只用一种荧光染料同时量 化来自不同病原体的数百种不同的核酸的装置和方法。

发明概述

本发明提供了同时量化测量来源于样品中一种或多种病原体的多种核酸的 方法和设备。

在一个示范性实施方案中，用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR、滚动循 环复制或T7转录线性扩增在单个反应孔中扩增所有的样品中的核酸和一种或 多种内部核酸对照，其中扩增缓冲溶液附加含有荧光标记的核苷酸或，优选地 荧光标记的引物，因此靶核酸和内部核酸对照的扩增子本身是荧光标记的。典 型地，一种或多种内部核酸对照以不同的拷贝数量和不同的浓度存在，例如， 内部核酸对照A以低浓度存在，以及内部核酸对照B以高浓度存在。低浓度的 内部核酸对照和高浓度的另一个内部核酸对照的存在扩大了方法的检测范围。 此外，从低至中等至高的不同浓度的两个以上(例如，三、四、五等)内部核酸对 照的存在可以允许在很宽的浓度范围中的非常精确的检测。