[发明专利]一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酞酸酯残留检测方法，具体的说是对邻苯二甲酸二己酯的一种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。

背景技术

邻苯二甲酸二己酯(di-n-Hexyl phthalate，DHP)是酞酸酯的一种。酞酸酯作为增塑剂在塑料的加工生产中尤其是聚氯乙烯(PVC)的加工生产中被广泛的使用。由于酞酸酯增塑剂与塑料基质之间没有形成共价键，而是以氢键和范德华力连接，彼此保持各自独立的化学性质，因而在接触到包装食品中所含的水、油脂时便会溶出。经过研究发现酞酸酯是一种环境激素物质，它干扰生物为保持体内平衡并调节生长过程的正常激素的产生、释放、转移、代谢、反应和消除，或在未受损的生物后代中引起不良的健康影响和内分泌功能的改变。美国环保局将六种酞酸酯列入重点控制的污染物名单中，我国优先污染物黑名单中包括邻苯二甲酸二己酯。目前，国内外有关邻苯二甲酸二己酯的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。近年来，国内外已经开展了对酞酸酯类免疫分析方法的研究，但国内外尚没有针对邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测的报道，为了弥补这一空白，有必要针对邻苯二甲酸二己酯建立一种酶联免疫检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测邻苯二甲酸二己酯残留的免疫学检测方法并且有较高的灵敏度和特异性。

本发明的技术方案：利用胥传来、徐丽广、马伟等(一种邻苯二甲酸二己酯人工抗原的制备方法)合成的免疫原免疫得到多克隆抗体，以邻苯二甲酸二己酯半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了邻苯二甲酸二己酯残留的间接竞争酶联免疫法。

一种邻苯二甲酸二己酯的酶联免疫检测方法，步骤如下：

(1)抗原的包被

以邻苯二甲酸二己酯半抗原与卵清蛋白OVA的偶联物作为包被抗原，以0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲溶液将包被抗原以1:5000～1:8000进行稀释，作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液200μL/孔作为封闭液，封闭2h；

(2)竞争反应

每孔分别加入以标准品稀释液PBST稀释的0.01ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL系列浓度之一的邻苯二甲酸二己酯标准品或处理好的样品50μL到各自的酶标孔中，将免疫制备的邻苯二甲酸二己酯多克隆抗体以抗体稀释液：含0.1％明胶、含0.05％吐温-20、pH7.4、0.01M的磷酸盐缓冲溶液PBST，按1:6000～1:9000比例稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(3)加酶标二抗

以抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP以1:3000～1:5000进行稀释，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；

(4)显色

每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；最后每孔加入终止液2M硫酸溶液100μL；用酶标仪450nm测吸光值A₄₅₀，与所作标准曲线对比算出待测样品的邻苯二甲酸二己酯浓度。

显色液配方：A液：0.933g柠檬酸，3.68g Na₂HPO₄·12H₂O，18μL 30％ H₂O₂用超纯水定容至100mL；B液：60mg 3，3/，5，5/-四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇中；使用前将A液与B液以5:1体积混合。

标准品稀释液PBST为含0.15mol/L NaCl、含0.5％吐温-20的0.01mol/L、pH7.4PBST溶液。

更详细的步骤为：

主要溶液配制

1)配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液：

Na₂HPO₄·12H₂O       3.62g

KH₂PO₄               0.2g

NaCl                 0.2g