[发明专利]一种肌苷的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌苷的发酵生产方法，尤其是应用于生产各种药物及其前体物、功能性食品等肌苷的发酵生产方法。

背景技术

在食品工业中，肌苷主要用于二步法生产5’-肌苷酸，由于食品增味剂需求的增加和对环境保护意识的增强，发酵法生产肌苷已成为生产第二代和第三代增鲜剂的主要途径，取代了化学合成法和水解法。存在已知的利用枯草芽孢杆菌属微生物发酵生产肌苷的方法，所述的微生物时候腺嘌呤缺陷型菌株，或者赋予了对各种物质，包括嘌呤类似物抗性的腺嘌呤营养缺陷型菌株(日本专利公开(KOKOKU)号38-23099，5417033，55-2956，57-14160，短杆菌属微生物(日本专利公开(KOKOKU)号51-5075，58-17592，Agric.Biol.Chem，42，399(1978)，对8—氮杂鸟嘌呤、磺胺胍、链霉素有三重抗性等等。微生物经诱变育种后能够产生核酸类物质。肌苷产生菌应该具有以下特征：(1)缺少sAMP合成酶：(2)解除在5’-IMP生物合成处的调节：(3)缺乏肌苷降解的酶系，如核苷磷酸化酶和核苷水解酶。肌苷发酵的生产菌种主要有枯草杆菌、短小芽孢杆菌和产氨短杆菌，其中枯草杆菌的磷酸酯酶活性较强，有利于将IMP脱磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，因而肌苷的发酵多采用枯草杆菌的腺嘌呤缺陷型。

目前主要用枯草杆菌，产氨短杆菌及短小芽孢杆菌为出发菌种。生产菌种首先要腺嘌呤与鸟嘌呤缺陷型。为了有效地积累肌苷，还应该选择核苷酸酶活性强而核苷酸磷酸化酶活性弱的菌株，以促进肌苷的生成和生成的肌苷不再分解，提高肌苷产量。柏建新等经诱变处理，获得一株缺失核苷水解酶活性的突变株JSIM-B-198。发酵50h-60h后，平均产肌苷18.38g/L。王敖全等M用枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)腺嘌呤缺陷形(ade-)Na18经一次亚硝基肌(MNNG)诱变处理及两次单菌落分离，获得能利用酶法制造葡萄糖三次结晶母液，发酵生产肌苷的变异菌株B:a，摇瓶肌苷产量在7.0克/升以上。杨志荣等分离鉴定出6株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)，筛选出腺嘌呤缺陷型和鸟嘌呤缺陷型菌株，摇瓶发酵最高产量达12.1g/L.

中国专利CN101104865属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法。具体地，本发明涉及从芽孢杆菌群中筛选出在含有6-乙氧基嘌呤的培养基中表现为有利生长的菌株，并从获得的菌株中筛选出表现为肌苷生产能力高的一种菌株，以获得肌苷生产能力改善的芽孢杆菌。

中国专利CN1410527一种新型肌苷产生菌及其生产肌苷的方法，该新型肌苷产生菌为经选育的肌苷高产突变株产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)GMA-1198CCTCC M201025。本发明所提供的生产肌苷的方法，其特点是用GMA-1198CCTCC M201025做发酵菌株，利用糖质原料和生长素进行摇瓶发酵。产肌苷最高可达28g/l。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种工艺稳定、产率高、生产成本低的肌苷生产方法。

本发明所采用的技术方案是：一种肌苷的生产方法，步骤为：A、一级种培养：将菌株放在一级培养基中培养，培养温度为30～32℃、旋转式摇床220±20rpm、培养时间10-15小时，得增值菌株；B、二级种培养：将步骤A所得的增值菌株再放到二级培养基中，培养温度为35±0.5℃、培养时间8-12小时，得放大菌株；C、菌株发酵：将步骤B所得的放大菌株放到发酵培养基中，进行发酵。菌株先后通过二级培养基后，繁殖很多活性相同，生物特性相同的菌株。