[发明专利]通过干扰巢蛋白表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，尤其是涉及一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。

背景技术

细胞骨架蛋白在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及纤维细胞形态方面具有重要作用。细胞骨架，按纤维直径的大小又可将其分为微管、微丝、中间纤维或称中间丝以及微梁格。中间纤维的分布具有严格的组织特异性。这一点已被应用于肿瘤临床鉴别诊断，以鉴别肿瘤细胞的组织来源。巢蛋白(巢蛋白)是第VI中间丝蛋白。在哺乳动物中，巢蛋白最早发现表达在发育中的神经系统和成年神经系统的神经前体细胞表面，随后在神经系统以外的其他部位如肝脏、血管内皮、骨骼肌、表皮基底层、毛囊、肾脏足细胞等也发现了巢蛋白的表达，而当这些组织细胞发育成熟以后，巢蛋白就停止表达，当成熟的细胞又发生再生(如缺血、坏死、新生瘤样变)时，巢蛋白又呈现返祖性表达。在恶性黑色素细胞瘤中，随着肿瘤侵袭性增强，巢蛋白的表达也增强。这些已发现的现象可能表明：巢蛋白与细胞的增殖和恶性度是有一定关系的。

目前尚没有任何关于巢蛋白对肿瘤细胞增殖、凋亡以及还未被人所知的功能的研究报道。这种中间丝蛋白参与什么样的信号通路，影响细胞什么方面的生物学功能，进而影响机体的功能，这些都是值得研究和探讨的方面。研究巢蛋白对于细胞的生长，增殖，凋亡，迁移，分化方面是否有影响，巢蛋白影响细胞的哪一些信号通路，也有助于应用在细胞治疗一些疾病，如癌症，细胞增殖性疾病，等等。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，具体是通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。

本发明所述的一种通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法，包括以下步骤：A.提供肿瘤的特定细胞株和培养条件；B.鉴定上述肿瘤细胞株表达巢蛋白的表达；C.加入待筛选的药物；以及D.培养48小时或更长的时间，检测巢蛋白的表达，检测结果与B步骤的结果进行比较，如果出现巢蛋白表达下调的情形，该待选药物成为抑制肿瘤增殖和/或促进细胞凋亡的先导药物。

优选地，所述步骤A中，所述的肿瘤细胞株是小鼠黑色素瘤B16细胞株或人黑色素瘤UACC903细胞株，所述培养基是通用的哺乳类动物细胞培养液，培养条件是5％CO₂、37℃。

优选地，所述步骤B中，所述鉴定方法是用免疫荧光细胞化学和RT-PCR方法鉴定巢蛋白的表达。

优选地，所述步骤C中，所述待筛选的药物是SiRNA序列。

优选地，所述步骤D中，所述检测巢蛋白的表达的方法是免疫荧光细胞化学和RT-PCR检测方法。

本发明首先通过对巢蛋白巢蛋白在不同肿瘤组织中的表达的研究，证实了巢蛋白在血管肉瘤和胃肠道间质肿瘤中的表达和恶性度成正相关。首次发现巢蛋白在胰腺腺癌，肝内胆管细胞癌，肺鳞癌和肺腺癌、急慢性粒细胞性白血病，血管肉瘤的肿瘤细胞中也有表达，目前均未见报道。

本发明以小鼠黑色素细胞瘤B16和人黑色素瘤UACC903为例，通过实验研究巢蛋白短暂表达下调对小鼠黑色素细胞瘤B16增殖的影响，以及利用慢病毒实验研究巢蛋白长期表达下调对小鼠黑色素细胞瘤B16增殖的影响。

本发明以SiRNA序列作为药物筛选的示例，验证了上述方法的可行性，通过建立长期干扰巢蛋白表达的小鼠黑色素瘤细胞系B16F10和人黑色素瘤细胞系UACC903，获得巢蛋白与肿瘤细胞生长，增殖，凋亡和迁移等生命活动关系的直接证据。首次发现干扰B16F10巢蛋白基因表达与对照组细胞相比倍增时间延长，细胞增殖减慢，更易于凋亡。首次发现干扰人黑色素瘤细胞UACC903的巢蛋白基因表达，降低UACC903迁移，使细胞增殖减慢，更易于凋亡。从功能上证明了巢蛋白在肿瘤细胞增殖发育上的重要作用。

因此，建立通过干扰巢蛋白的表达来筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法是可行的，也是非常有应用前景的。本发明首次提出了这种筛选抑制肿瘤增殖和促进细胞凋亡的药物的方法。

本发明在实验过程中已经完成了对三种设计的SiRNA序列的筛选，表明其中有两种SiRNA序列有效地干扰小鼠B16细胞株巢蛋白表达，从而抑制小鼠黑色素细胞瘤B16的增殖和促进肿瘤细胞凋亡。基于同样的原理和操作，我们也可以对其他潜在的抗癌药物进行筛选。