[发明专利]一种猪氟烷基因基因型的检测方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种基因检测方法，特别涉及一种猪氟烷基因基因型的检测方法，具体来说是一种应用荧光定量PCR技术检测猪氟烷基因不同基因型的方法。

背景技术：

猪氟烷基因又称骨骼肌钙离子释放通道基因或兰尼定受体基因，由一对等位基因Hal^N和Halⁿ组成，并构成Hal^NN(野生型)、Hal^Nn(杂合型)和Halⁿⁿ(突变型)3种基因型，是导致猪应激综合症的一个主效基因，猪应激综合症的典型症状为猪恶性高热、肌肉强直、突然死亡，以及屠宰后肉质变差，形成劣质肉。由于猪应激综合症产生的猪应激死亡、劣质肉已给世界各国的养猪生产和猪肉的销售加工造成了巨大损失，因此，需要通过检测来分辨并剔除猪群中氟烷基因的Halⁿ基因，以避免猪应激综合症的产生。目前检测猪氟烷基因的方法主要有生理、生化和分子生物学检测。生理检测是使幼猪吸入一定浓度的氟烷气体被麻醉后，表现出肌肉痉挛、四肢僵直的为氟烷阳性(Halⁿⁿ)，未出现任何症状、四肢松软的为氟烷阴性(Hal^NN)或杂合子(Hal^Nn)。此法简单易操作，但检测准确性不高，且只能检出氟烷阳性。生化检测是通过检测猪血液中氟烷基因连锁的酶或血型基因来间接选择基因型，此方法准确性较高，但猪不同品种、品系间连锁群关系有差异，且与氟烷基因位点间有互换，使此法的应用受到很大限制；目前最为常用的是分子生物学检测方法。文献记载的猪氟烷基因分子生物学检测方法为普通聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction PCR)，主要有限制性酶切片段长度多态性分析法(restriction fragment lengthpolymorphism PCR-RFLP)和一步PCR法。PCR-RFLP法使用一对引物进行普通PCR扩增，然后对扩增产物进行限制性酶切，凝胶电泳，根据电泳条带的差异来判断基因型。该方法操作步骤多，过程复杂，耗时较长，酶切的完全与否直接影响对结果的判断，酶切的程度也较难控制，不同产物、不同内切酶的酶切时间都不相同，因此要求实验操作者具有丰富经验。一步PCR法，该法使用两对引物在一个反应体系中进行普通PCR扩增，不同的基因型可以得到不同的PCR扩增产物，然后制作凝胶，电泳PCR产物判断基因型。相对PCR-RFLP方法，该方法不需要酶切，操作相对简单，但由于使用两对引物扩增产物，容易对PCR扩增效率和结果的判断产生不利影响。另外，以上两种方法都需要制作凝胶，使操作人员接触有毒有害试剂；电泳的电流强度与时间难以控制，容易电泳失败，导致条带无法看清而影响基因型的判定。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪氟烷基因基因型的检测方法，所述的这种猪氟烷基因基因型的检测方法要解决现有技术中的检测猪氟烷基因基因型的方法准确率低、操作步骤多、过程复杂、时间长、检测试剂有毒的技术问题。

本发明是一种猪氟烷基因基因型的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

a)对猪氟烷基因进行PCR扩增，然后对扩增出的碱基片段进行碱基测序，确定猪氟烷基因的突变位点，根据突变位点两端的碱基序列设计两组引物，其中一组引物的上游引物3’端和野生型的基因位点匹配，另一组引物的上游引物3’端和突变型的基因位点匹配，两组的下游引物相同；

b)将待检测猪的样品DNA分别与野生型引物、突变型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次序即可得出猪氟烷基因的基因型。

进一步的，所述的野生型的基因位点的上游引物为5’CAA TGG TGT GGCCGT GT 3’，野生型基因位点的下游引物为5’GCC CAG ACC TGG TGA CAT A3’，突变型基因位点的上游引物为5’CAA TGG TGT GGC CGT GC 3’，突变型基因位点的下游引物为5’GCC CAG ACC TGG TGA CAT A 3’。