[发明专利]rhDSL重组蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的蛋白及其制备方法，具体涉及一种rhDSL重组蛋白及其制备方法。

背景技术

Notch信号传导通路广泛存在于脊椎和非脊椎动物中，是影响细胞决定的重要通路之一，在进化上具有高度的保守性。Notch信号传导通路由Notch受体、配体及其下游的信号传导共同组成。相邻细胞间通过Notch受体传递信号可以调节包括干细胞在内的多种细胞的分化、增殖和凋亡，影响器官形成和形态发生。目前已经发现的人的Notch配体有Jaggedl、Jagged2、Deltal、Delta3、Delta4。Notch配体的胞外区含有数量不等的EGF样重复序列以及N端保守的DSL(Delta/Serrate/Lag2)结构域，该DSL结构域在结合与活化Notch受体的过程中起关键作用。

来自于野生Notch配体的重组蛋白或者多肽被认为是有效的Notch激活剂。体外实验已经证明，从Jaggedl、Deltal中衍生而来的重组蛋白及多肽具有Notch激活特性(Shimizu K，et al.J Biol Chem，1999，274(46)：32961～32969)。Han等(Blood，2000，95(5)：1616～1625)通过对人类Deltal蛋白结构的功能域的研究，成功的选出了具有Notch受体激活功能的Deltal最小功能蛋白序列，包括进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸，克隆并表达纯化出具有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)标签的重组融合蛋白，命名为hD111^NDSL。经对现有技术的文献检索发现，中国专利公开号为CN101063127A，专利名称为“GST-hDSL重组蛋白的制备方法”，该专利中介绍的制备方法步骤为“第一步，构建重组表达质粒pGEX-2T-hDSL；第二步，诱导表达重组表达质粒pGEX-2T-hDSL；第三步，将表达产物依次经变性，复性，离心，冲洗，洗脱后纯化得到GST—hDSL重组蛋白的。”该方法虽然可以得到较高浓度(0.5mg/mL以上)和纯度(95％以上)的GST-hDSL重组蛋白，但是所得到的重组蛋白分子量较大、结构较为复杂，不利于生产中成本的节约及相关体内外研究中的运用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种rhDSL重组蛋白及其制备方法，使其进一步简化了hD111^NDSL重组蛋白的结构，首次构建了含6×His(组氨酸)标签的重组rhDSL蛋白，rhDSL是一种新的结构简单、分子量较小的Notch配体衍生多肽。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的rhDSL重组蛋白，为含有6×His(组氨酸)标签的Notch配体Delta-like-1的衍生多肽。

所述的衍生多肽，由含有进化中的保守结构区DSL和与之相邻的N-端的50个氨基酸构成，共99个氨基酸，其氨基酸序列为(Blood，2000，95(5)：1616～162)：

LHTDSPDDLATENPERLISRLATQRHLTVGEEWSQDLHSSGRTDLKYSYRFVCDEHYYGEGCSVFCRPRDDAFGHFTCGERGEKVCNPGWKGPYCTEPI。

所述rhDSL重组蛋白以pQE30为表达载体构建重组表达质粒pQE30-hDSL，以大肠杆菌DH5α为宿主进行重组蛋白的表达，在大肠杆菌中表达后以包涵体形式存在。

本发明所涉及的rhDSL重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

第一步，构建rhDSL的重组表达质粒pQE30-hDSL；

第二步，以大肠杆菌DH5α为宿主表达rhDSL重组蛋白；

第三步，采用Q Sepharose阴离子交换层析与金属离子(Ni²⁺)亲和层析相结合的纯化方法进行rhDSL重组蛋白的纯化，得到高纯度(纯度>99％)低内毒素含量的rhDSL重组蛋白。