[发明专利]固体5’-磷酸二酯酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从麦芽根中制备高活力固体5’-磷酸二酯酶的方法，以及应用该高活力酶降解高浓度核糖核酸(RNA)获得高浓度5’-核苷酸。

背景技术

5’-核苷酸为重要的生化物质，为多种核酸药物的中间体。近年来，研究发现母乳中微量的5’-核苷酸类物质对婴儿的免疫力、肠道发育、肝功能以及生长起着重要作用。向婴儿配方奶粉中添加5’-核苷酸的模拟母乳已成为维持婴儿健康重要手段之一。

工业上，5’-核苷酸一般由RNA酶解或应用化学合成的方法由相应的核苷磷酸化制得。酶解RNA一般都采用由桔青霉发酵产生的核酸酶P1，发酵法生产核酸酶P1设备投资大，发酵工艺复杂，且需防止桔青霉产生的有害物质混入核酸酶P1而带入产品，为后续产品的分离纯化带来麻烦；桔青霉发酵生产过程中产生的孢子混入空气，对人体健康也是有危害。中国专利公开号：CN101012469A(申请日2007.2.14)提供了一种采用液体5’-磷酸二酯酶制备5’-核苷酸类物质的方法；酶解率达70％以上，5’-核苷酸产量大于15mg/ml。

作者等曾于2002年报道了采用麦芽根中5’-磷酸二酯酶制备5’-核苷酸的方法《华东理工大学学报》2002年28卷第4期。并首先将其应用于工业生产，规模制备5’-核苷酸，2000年通过山东省科技厅组织鉴定。

上述专利和文献提供的技术，酶液不易保存，杂酶较多，转化率低，且RNA只能在1-2％浓度范围酶解，不能获得高浓度5’-核苷酸溶液，生产效率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种固体5’-磷酸二酯酶(或称核酸酶)及其制备方法和应用，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明所述的固体5’-磷酸二酯酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)液体酶的提取，该过程为现有技术，如作者等在《华东理工大学学报》2002年28卷第4期中报道的技术，具体的方法如下：

将麦芽根与水或缓冲液混合，然后10～70℃浸泡1～24小时，最佳为温度20-50℃，最佳浸泡时间为2-8小时，过滤收集浸泡液，浸泡液2500-3500分钟下离心分离，收集离心液，然后离心液超滤浓缩，使体积为原为的1/2-1/3，获得浓缩液，为液体酶；

水或缓冲液的重量为麦芽根的8～12倍；

所述缓冲液的pH为4-10，优选乙酸-乙酸钠，盐酸-Tris、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠等，最优选浓度为10-100mmol/L，pH在5.5-7.5之间的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；

可先将麦芽根粉碎至20-400目，最优选100-200目，然后再与水混合；

所述麦芽根为各种麦科植物发芽后形成的须根或为各种植物的须根，或者为啤酒工业副产物麦芽根；

(2)在步骤(1)的浓缩液中加入沉淀剂，将5’-磷酸二酯酶分离出来，收集沉淀物，为糊状5’-磷酸二酯酶；

所述沉淀剂为硫酸铵或有机溶剂，所述有机溶剂优选乙醇；

当沉淀剂选用硫酸铵时，其用量为在所述浓缩液中达到40-80％饱和度，沉淀时，可先在每升浓缩液加入283克硫酸铵，达到40％饱和度，待其完全溶解后放置1-4小时，离心或过滤除去沉淀，然后再加入285克硫酸铵搅拌溶解，使硫酸铵的饱和度为80％，然后放置2-8小时，离心或过滤可得到糊状沉淀物；

当沉淀剂为乙醇时，乙醇的重量用量为浓缩液的3～5倍；

(3)然后将沉淀物在4～20℃对重量浓度对0～1％的甘油水溶液透析10～48小时，去除沉淀剂；

(4)将透析液干燥，即可获得5’-磷酸二酯酶粉末，酶的活性为1万单位/g以上；固体酶可有效的保护酶的活性，并延长酶的贮藏能力。

所述透析为一种常规技术，可使用透析袋，或超滤。

所述干燥方法，优选喷雾干燥，进风温度为120～140℃，出风温度为70-90℃，酶液预热温度为40-60℃。

上述方法制备的5’-磷酸二酯酶可以作为催化剂降解核糖核酸而获得5’-核苷酸，其制备5’-核苷酸的方法包括如下步骤：

将重量浓度为3％～6％的核糖核酸与上述方法获得的固体5’-磷酸二酯酶进行反应，于60-80℃酶解反应1-10h，最佳为3-5h，酶解反应后灭活10min，获得5’-核苷酸，酶活加入量为70-140U/mL，最佳为80-120U/mL；

酶解的转化率可达到90％以上，用高效液相色谱定量，酶解液中5’-核苷酸浓度可达到24-54g/L以上；