[发明专利]一种高灵敏度检测肺炎支原体的靶序列及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是涉及一种聚合酶链式反应扩增P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)的重复序列，从而高灵敏度特异检测临床样本肺炎支原体的方法，以及利用该方法获得的实时荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

支原体肺炎是一种非常严重的传染性疾病，在肺炎中，支原体肺炎约占15％～20％，并且导致多种并发症，支原体肺炎是由肺炎支原体引起的急性肺部感染。肺炎支原体广泛存在，无地区性差别，平时散发，支原体肺炎每4～5年有1次流行。发病季节不明显，寒冷季节发病率较高，占住院肺炎的10％～20％，流行期间可占30％。肺炎支原体的感染可发生在不同年龄的小儿，在年长儿多见，在新生儿中报道不多。蒋巍等报道了新生儿感染14例，认为孕妇生殖道支原体感染，经宫内或产道可感染胎儿和新生儿，是引起早产、新生儿低体重、新生儿肺炎和中枢感染的主要原因。肺炎支原体的感染率有逐年增多的趋势。支原体感染的临床主要表现为咳嗽、咳痰、哮喘、气促、胸闷、胸痛及不同程度的发热和惊厥等。

肺炎支原体感染也可导致一系列呼吸系统外疾病，可引起支原体血症，直接侵犯各系统、组织引起病变。国外报道，从肺炎支原体呼吸道感染的病例血液中直接分离出肺炎支原体，提示肺炎支原体可进入血液，存在呼吸系统以外的部位增殖的可能性。支原体感染引起的肺外并发症常累及心血管系统、血液系统、中枢神经系统、皮肤及肝肾器官。国外报道，皮疹发生率为25％，皮疹形态可为红色斑丘疹、麻疹样或猩红热样皮疹，也可有水疱、大疱性疹，7％为中枢神经系统损害，以支原体脑炎多见，可并发心肌炎、心包炎甚至心力衰竭，发生率4％-5％，泌尿系统可出现蛋白尿、血尿和肾功能衰竭。发病机制除直接侵袭、毒紊作用外，目前倾向于免疫损伤。

石蕙文等报道支原体肺炎并发一过性单纯红细胞再生障碍性贫血1例，其原因可能与感染直接抑制红细胞DNA合成或免疫紊乱有关。支原体肺炎造成溶血多为自身免疫性溶血，随着支原体肺炎的好转，患儿红细胞系造血恢复，预后良好。

可见，要消灭肺炎支原体需要多方努力，如发展快速诊断方法、研制新药、进行分子机制研究和疫苗研究等，其中发展快速诊断方法最为紧迫。目前常用的检查方法包括：冷凝聚试验、间接血凝抑制试验、补体结合试验、肺炎支原体的培养、聚合酶链反应(PCR)。支原体肺炎的诊断有病原体培养、多种特异性血清学检查，近年又有基因探针及DNA、PCR方法。而冷凝聚试验、间接血凝抑制试验、补体结合试验及肺炎支原体的培养由于特异性差、敏感性低等问题在临床应用价值受限。冷凝聚试验、支原体抗体测定时两者的高峰出现晚，多在2～4周，并与患者年龄、免疫功能、感染轻重、病程的长短有密切关系。肺炎支原体感染后血清冷凝聚抗体阳性者，仅仅占45％～75％。婴幼儿由于免疫系统发育未完善，部分免疫功能低下，在肺炎支原体感染时抗体产生不足，从而影响检出率，咽拭培养分离肺炎支原体，对于一些血清学不能诊断肺炎支原体的患儿，可提高检出阳性率。LISA方法测定特异性MP-IgA，其阳性率达56.01％；用颗粒凝聚法测定的MP-IgM，其阳性率达60.81％。目前国内外一致认为MP-IgM、MP-IgG等特异性抗体测定是临床诊断肺炎支原体感染较为可靠的指标之一。Granstorm认为，测定MP-IgA抗体比MP-IgM更有价值。其原因是MP-IgM抗体的产生可因浆细胞受非相关抗原(如呼吸道病毒等)刺激后出现非特异反应，而MP-IgA的产生不受这些因素的影响。在MP-IgA阳性的基础上，MP-IgM的进一步的上升或下降可以提示有无支原体感染的可能。

近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，特异性好，速度快等优点在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法。