[发明专利]一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法

权利要求书

1.一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标片段长度为139bp，引物和探针序列为：

引物1：5`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)

引物2：5`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)

探针1：5`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)

或探针2：5`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)

或探针3：5`-TGTGGTGACAGATCCGAA-3`(Seq No.5)

或探针4：5`-TTCGGATCTGTCACCACA-3`(Seq No.6)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于标记探针5`端的荧光发光基团为可以FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行定性或定量分析。

4.根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于，使用人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列如下：

ACCACAGAAGUCCCUGAAAGAGCUGCAGGAAAUGGACAAAGAUGAUGAGAGUCUAAUUAAGUACAAGAAAACGCUGCUGGGAGAUGGUCCUGUGGUGACAGAUCCGAAAGCCCCCAAUGUCGUUGUCACCCGGCUCACC(139bp)(Seq No.7)。

5.根据权利要求1所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于，可形成定量检测试剂盒，试剂盒组成包括：

组成成分(20人份/盒)          体积

One step RT-PCR反应缓冲液    380μl

混合酶                       60μl

RNA标准品                    120μl

RNA标准品                    220μl

RNA标准品                    320μl

RNA标准品                    420μl

DEPC水                       1ml

其中，One step PCR反应组分(终浓度)包括：50mM Tris-HCl(Ph 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。混合酶的组成成份(终浓度)包括：0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。另外，探针1的5`端标记的发光基团为FAM，在3`端标记的淬灭基团为Eclipse。

6.根据权利要求5所述的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，其特征在于，操作步骤如下：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量提取好的总RNA并补充DEPC水(RNA阳性对照品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。