[发明专利]一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法，属于分子生物学领域。

背景技术

随着人类基因组图谱的完成，人们开始进入后基因组时代，重点也转向了研究各基因在生命中的作用，包括基因在生长发育、遗传、疾病、外型体征等方面的作用。其中，对于RhoGDP dissociation inhibitor(GDI)beta基因(ARHGDIB基因)表达的研究也越来越多。

基因表达的检测有几种方法。经典的方法是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测、分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于研究特定RNA分子。这些方法包括RT-PCR、原位杂交、NORTHERN凝胶分析、打点或印迹打点、S-1核酸酶分析、RNA酶保护研究以及基因芯片等。

荧光探针PCR技术是今年兴起并得到快速发展的技术，是将同时带有关联的荧光发光基团(能量供体)和淬灭基团(能量受体)的荧光探针结合PCR技术而产生的一种新的检测技术，具有灵敏度高、特异性强，且不易发生产物污染等特点，包括Taqman探针技术、分子信标(Beacan探针)等，由于该技术操作简便，检测速度快，且各方面性能都有优势，目前在临床、研究等核酸检测领域得到广泛的应用。

本发明将RT-PCR与荧光探针技术结合，通过广泛筛选和优化检测引物和探针，实现了快速准确的对ARHGDIB基因mRNA进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简便的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法。

为解决上述问题，本发明提供了一种使用一步法荧光RT-PCR技术对ARHGDIB基因mRNA进行定量的方法，根据GeneBank序列号为NC_000012的基因序列为模板，设计了一对引物及特异性探针，检测长度为139bp的目标mRNA，其引物探针序列分别为：

引物1：5`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3` (Seq No.1)

引物2：5`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`    (Seq No.2)

探针1：5`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`  (Seq No.3)

或探针2：5`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)

或探针3：5`-TGTGGTGACAGATCCGAA-3`     (Seq No.5)

或探针4：5`-TTCGGATCTGTCACCACA-3`     (Seq No.6)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

设计的探针跨越了NC_000012基因序列中第111098-111743位核苷酸的内含子，分别与其两端的外显子特异性匹配，这样可非常有效的避免基因组DNA对实验结果的影响，同时也省去了使用DNA酶对样本进行消化用以去除DNA干扰的步骤。

上述方法中使用的探针，其5`端的荧光发光基团可为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团可为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

本发明提供的使用荧光RT-PCR技术定量检测ARHGDIB基因mRNA的方法是使用一步法RT-PCR的技术，使操作更为简便、快速。使用已知浓度的人工合成的RNA序列制作标准曲线，能对标本中的ARHGDIB基因mRNA进行定量分析。其人工合成的RNA序列如下：ACCACAGAAGUCCCUGAAAGAGCUGCAGGAAAUGGACAAAGAUGAUGAGAGUCUAAUUAAGUACAAGAAAACGCUGCUGGGAGAUGGUCCUGUGGUGACAGAUCCGAAAGCCCCCAAUGUCGUUGUCACCCGGCUCACC(139bp)(Seq No.7)