[发明专利]一种人巨细胞病毒(HCMV)荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速而且方便的人巨细胞病毒(HCMV)荧光PCR检测方法，可同时检测HCMV基因组的UL122基因和UL123基因，属于分子生物学领域。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)也称人疱疹病毒5型(Human herpesvirus 5)，属a疱疹病毒亚科，HCMV是人类先人性病毒感染的最常见病原之一，可致感染患儿中枢神经系统受累、多器官损害、智力降低、耳聋等；在正常健康人中可引起单核细胞增多症；在免疫缺陷者一如器官移植受者一、获得性免疫缺陷综合征患者一及癌症患者一中可引起严重的感染，甚至致死。它和弓形体、风疹病毒、单纯疱疹病毒、梅毒螺旋体合称为人类五大生物致畸因子。鉴于HCMV在临床疾病中的重要作用，已经引起医学界的广泛重视。

在疱疹病毒科中，HCMV基因组最大，约235～240kb，分子为150～160×10³KDa。HCMV基因的转录及翻译受其自身及宿主细胞的调控，并具有时相性，分为IE(即刻早期)，E(早期)和L(晚期)。

HCMV病原学检测

(一)血清学诊断方法

HCMV感染的血清学诊断方法通常有补体结合试验(CF)，酶免疫试验(EIA)等，CF法敏感性低，而EIA则在高效价血清标本检测时分辩率低下。

1.CF法：

用于CF法的抗原大多数从感染CMV实验株如AD169的成纤维细胞中提取，抗原提取方法往往会影响检测效果，几年前的重要改进是用甘氨酸提取CMV的CF抗原，增加了实验的敏感性.尽管如此，CF法敏感性很低，因而目前不再应用。

2.EIA法：

(1)EIA法检测CMV抗体：

有好几种CMV抗体检测ELISA试剂盒供应，一般几小时可出结果，许多比较性研究证实ELISA抗体效价高，操作容易，无需虑及血清的抗补体作用，但在ELISA检测中，某些血清与正常细胞抗原有非特异性反应而产生假阳性，若提高起始稀释度以排除假阳性又会降低实验的敏感性，故需做重复试验并设定正常细胞抗原对照.CMV特异性的IgM-ELISA试剂盒已有供应，但如同所有的IgM检测一样，可能受类风湿因子等干扰，因而血清标本需预处理.CMV的血清检测也包括中和病毒感染的抗体测定，血清的中和抗效价常不变，很少超过1∶2000，试验需要活性良好的补体，有一定技术难度。

(2)EIA法检测CMV抗原：

用单克隆抗体进行EIA，检测CMV抗原是近几年研究的重点，现已可测定CMV的中和抗原(至少3种蛋白质)，及各种结构蛋白，调节蛋白.单克隆抗体能在感染后的几个小时内检测到成纤维细胞核内的CMV抗株，离心可帮助CMV吸附于单层细胞，效果可提高4倍，尿与气管肺泡洗液的培养结果尤佳.但由于血液白细胞层常有细胞毒性，经离心会使单层细胞受损，反而降低了检测阳性率。

3.乳胶凝集法：

乳胶凝集法测定CMV抗体是筛选血、器官供体的重要方法，几分钟内可出结果，误差5％(包括假阴性)，判定结果的主观性是误差的明显因素。

4.免疫吸印法：

将高分辨率的凝胶电泳和高灵敏度的免疫固相检出法相结合，凝胶电泳使混合在一起的病毒成分和细胞成份分开，再通过敏感的生物分子亲和技术检测，克服了CF试验敏感性差，EIA分辨率低的缺陷.同时，整个反应只需16h左右即可作出明确的诊断，快速且简便.HCMV主要结构蛋白150和38KDa出现于大部分病人血清中，并与HCMV-IgG、HCMV-IgM均起反应，极具代表性，可作为感染HCMV感染的指标。

(二)核酸杂交：

目前HCMV感染的诊断技术已从生物学病毒分离防和免疫学检测抗原抗体，进入到对基因组进行诊断的分子生物学水平阶段，通过标记的核酸探针用分子杂交方法检测标本微量的病毒DNA，具有特异性强，灵敏度高的优点，同时此法，不仅能诊断HCMV的活动性感染，而且还能确证潜伏感染.用高比活性放射性同位素检测HCMV，DNA克隆片段及放射自显影检测方法.灵敏度可达0.5pg，特异性可达100％.如用光敏生物素标记探针检测HCMV DNA，灵敏度达10～50pg，由随机引物延伸法和缺口平移法标记的生物素探针灵敏度分别为10～50pg和10pg。(三)病毒的分离(细胞培养)：