[发明专利]一种核酸等温扩增检测甲肝病毒的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种甲肝病毒(HAV)核酸等温扩增检测方法，采用逆转录-转录和纳米金探针检测层析杂交原理，其扩增对象为从HAV中提取的RNA模板；其特征在于，RNA模板通过采用逆转录酶、核糖核酸酶H以及RNA聚合酶等温扩增，产生的大量RNA扩增子和纳米金颗粒标记的检测探针、生物素(或地高辛)标记的捕获探针结合形成杂交复合物引起光学性质变化，最后该复合物和固定在层析膜上亲和素(或抗地高辛抗体)结合形成显色检测条带。

2.根据权利要求1所述的检测方法，采用了扩增HAV靶基因的寡聚核苷酸引物和探针：引物具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，其中SEQ ID NO：25’端含有RNA聚合酶识别的启动子序列；检测探针具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4序列；捕获探针具有SEQ I D NO：5序列。这些引物和探针或者是包含有上述序列的向5’端或和3’端延长的序列；或者与上述序列同源性大于85％的序列；或者上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其步骤依次包括：

(1)RNA模板在60～70℃下解链后降温；

(2)加入逆转录酶、核糖核酸酶H和RNA聚合酶，在引物的引导下于37～42℃进行等温扩增，获得RNA扩增子；

(3)利用纳米金颗粒标记的寡核苷酸探针检测扩增子，并被生物素标记寡核苷酸探针结合捕获，通过层析膜上的条带显色反应获得检测结果。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的逆转录酶为鸟成髓细胞瘤病毒逆转录酶或鼠白血病病毒逆转录酶；所说的RNA聚合酶为T3RNA聚合酶或T7RNA聚合酶。

5.根据权利要求1和5所说的检测方法，其特征在于，所说的T3RNA聚合酶所识别特异性启动子序列为5’AAT TCAATT AAC CCT CAC TAAAGGG3’；所说的T7RNA聚合酶所识别特异性启动子序列为5’AAT TCT AATACG ACT CAC TAT AGG G3’。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所用的纳米金颗粒直径为1～100nm，纳米金颗粒上的寡核苷酸探针SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4长度为10～100bp，且连接前经过巯基化或烷巯基化处理；所用的捕获探针SEQ ID NO：5长度为10～50bp，其5’端可为生物素或地高辛标记。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所用的固定有亲和素或抗地高辛抗体(对应于捕获探针5’端标记生物素或地高辛)的层析膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所说的显色反应为杂交后在层析膜上出现蓝紫色显色条带。

9.一种利用权利要求1所述检测方法组装的试剂盒，其组成为：包含有引物I和II、逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶的反应缓冲液、纳米金颗粒标记的寡核苷酸检测探针、生物素(或地高辛)标记的寡核苷酸捕获探针、带有亲和素(或抗地高辛抗体)标记的层析膜。

10.一种利用权利要求1所述检测方法组装的甲肝病毒核酸等温扩增检测试剂盒，可以用于甲肝病毒或甲肝减毒疫苗中分离的RNA检测。