[发明专利]一种核酸等温扩增检测甲肝病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及甲肝病毒或减毒疫苗的RNA扩增检测技术。

背景技术

甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV，简称甲肝)是病毒性甲型肝炎这一传染病的病原体，它属于细小RNA病毒，基因组为一条约含有7400个核苷酸的正链RNA，病毒颗粒呈廿面体结构、大小约27～32nm。甲肝病毒主要经过粪口途径传播，饮水的污染往往是造成甲肝流行的主要原因，在我国成人中HAV感染率约为50～70％；据卫生部公布资料显示，全国甲型肝炎发病率在16/10万左右，同时甲型肝炎作为一种世界性传染病，全球约40亿人受到其威胁。HAV病毒感染后可在体内潜伏14～45天，其临床症状包括发热、疲倦、恶心厌食和腹部不适等，同时2/3的感染成人会出现黄疸，当HAV急性感染时可能导致人死亡、死亡率为1～3‰。近年来，在我国由于人口流动的增加，加快了甲肝的传播范围和速度，发病特点呈现病毒感染向大年龄推移、易感人群不断累积、甲肝流行危险性增加。目前控制预防甲肝流行的主要手段是使用甲肝减毒活疫苗进行免疫接种预防。

除了HAV的预防控制，也需要一种灵敏快速的检测方法用于HAV病毒的诊断。目前甲肝病毒的检测方法主要有病毒培养、抗原或抗体检测、RNA检测四种。病毒培养需接种在敏感细胞上，但由于生长缓慢，需3～4周时间，因此不用于临床HAV常规诊断。抗原或抗体检测在临床检测中使用广泛，但由于方法学上抗体需在病毒感染后一段时间出现、并且抗原抗体存在非特异性反应，影响了检测的灵敏度和特异性。HAV RNA检测主要是通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术实现，特别是近年荧光RT-PCR技术的发展，推动了HAV RNA检测的进步。虽然荧光RT-PCR技术检测HAV RNA灵敏度很高，但使用时需要复杂昂贵的循环变温设备，并且对操作人员的技术要求较高，限制了该技术的大规模推广使用。核酸等温转录扩增和纳米金探针检测方法(Nucleic Acid Isothermaland Transcriptional Amplification with Gold Nano-particle Probes，NITAG)是一种利用纳米金探针快速检测恒温扩增产物的新型核酸检测技术(原理参见附图1)。具体说来，NITAG技术首先利用一种多酶复合体所具有的逆转录酶、RNase H和依赖DNA的RNA聚合酶活性，在体外等温扩增核酸模板获得大量RNA扩增子，然后纳米金标记的寡核苷酸探针和这些RNA中的靶序列杂交形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网络结构，由此引发纳米金粒子光学性质的变化，产生杂交信号以杂交液/板/试纸颜色变化显示，存在相互作用的杂交液/板/试纸显示为蓝色，没有作用的显示为红色。利用该技术，微量RNA模板可通过等温扩增的模板拷贝数和纳米金探针检测的显色信号双级放大而得到检测，该检测技术具有无需特殊昂贵设备、检测灵敏快速、结果直观可见等优点。目前采用NITAG技术检测HAV RNA的应用尚无公开报道，通过检测可以快速有效地诊断甲肝病毒或其减毒疫苗，具有检测准确灵敏、快速简便的特点。

发明内容

所要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于NATAG技术的甲肝病毒或减毒疫苗RNA检测方法和试剂盒，对来自HAV的RNA进行等温扩增和纳米金探针检测。

技术方案

本发明提供一种基于NITAG技术扩增甲肝病毒或减毒疫苗RNA的5’端非编码区(5’-UTR)寡聚核苷酸引物对和探针，其中引物对具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列(SEQ ID NO：25’端含有能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列)；检测探针具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列(前者5’端和后者3’端分别经过己烷巯基化处理)，捕获探针具有SEQ IDNO：5的序列(5’端生物素Biotin标记)。

SEQ ID NO1：5’-CTTCCAgggCTCTCCCCTTgC-3’21bp

SEQ ID NO2：5’-AATTCTAATACgACTCACTATAggg AAgATCAAAgAggTTCATg-3’44bp

SEQ ID NO3：5’HS-(CH₂)₆-[gAgCTgTAggAgTCTAAAT]19bp