[发明专利]一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚层细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种利用单层培养技术 制备和分离定型内胚层细胞的方法。

背景技术

自1981年第一次建系以来，小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic Stem Cell， mESC)已经成为细胞生物学和实验医学领域的主要进步。它使小鼠基因组的常 规操作成为可能并且为细胞替代治疗带来了巨大前景。作为哺乳动物早期发育 的体外模型，它有潜力提供各种在成体中数量有限的分化细胞类型。

胚胎干细胞是从哺乳动物囊胚内细胞团中分离得到的具有全能性的干细 胞，在体外分离培养后可以无限增殖并具备分化为全身各种细胞类型的潜力。 从胚胎干细胞得到有功能且可用于移植的特异组织类型的细胞是致力于治疗 各种损伤及退行性疾病的再生医学的一个长期目标。最近的许多文献报道了由 胚胎干细胞分化得到各种特异组织类型的细胞，如神经细胞、肌肉细胞、血细 胞以及肝细胞等。

为了产生特定需要的细胞类型并最终将它们应用到移植，必须致力于达到 高效的分化并且获得相对均一的细胞群体。此外，还须确认细胞的真实“身份” 并进一步对其进行定向分化。

以肝脏细胞为例，肝实质细胞是成体肝脏中主要的细胞类型并且履行肝脏 的主要功能。它们由胚胎中腹部前肠段的定型内胚层(Definitive Endoderm，DE) 细胞分化生成。定型内胚层产生所有内胚层的器官，包括肝、胰、肺和肠等。 但是，在体外用ES细胞重复这个胚胎发育过程遇到的一个关键问题是区分定 型内胚层和其它胚层的细胞，尤其是胚外来源的细胞。胚外内胚层细胞的衍生 物内脏内胚层(Visceral Endoderm，VE)和脏壁内胚层这两类内胚层和定型内胚 层及肝实质细胞共享许多重要的功能和分子水平上的相同性。这两类组织都有 上皮样形态，分泌血清蛋白，参与糖脂代谢，还是临时的造血场所。直到最近， 仍然没有找到定型内胚层表达而胚外内胚层不表达的特异标记。这使得在胚胎 干细胞的不均一分化培养体系中很难确切的鉴定这些细胞。

大多数原先的关于胚胎干细胞自发或定向分化成肝细胞的报道没有很好 的解决这个问题。确定这些细胞的真实“身份”是存在问题的，因为它们用作 代表肝细胞的许多基因也表达在胚外内胚层(如Alb，Foxas，Tcfs，Cebps， Gatas和Hnf4等等)，因此在分化过程中最好能避免胚外内胚层细胞的产生。

因此，建立一种高效的由胚胎干细胞定向分化成定型内胚层细胞的诱导方 法对于后续的分化得到肝、胰等可用于细胞治疗的特异组织类型细胞至关重 要。需要引起重视的是，如上讨论，这一诱导分化方法必须能有效的避免胚外 内胚层细胞的分化产生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于制备定型内胚层细胞的培养基。

本发明的另一目的在于提供一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚 层细胞的方法。

在本发明的第一方面，提供一种制备含定型内胚层细胞的细胞群方法，所 述方法包括：

(1)培养容器中加入诱导分化培养基，所述的培养基包括：

Neurobasal培养基                    400-570ml/L；

DMEM/F12培养基                      400-570ml/L；

N-2添加物                               3-7ml/L；

B-27添加物                             5-15ml/L；

牛血清白蛋白                      0.34-0.64mg/L；

单-二羟丙硫醇                      0.09-0.225mM；

活化素A                               10-50mg/L；

(2)将胚胎干细胞接种到(1)的培养基中，培养所述的胚胎干细胞3-10 天，诱导胚胎干细胞分化，从而获得含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群 中定型内胚层细胞数量占细胞总数的40％以上。

在另一优选例中，所述的培养容器是经明胶包被的培养容器。

在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是经消化的胚胎干细胞。