[发明专利]盐屋霉素的生物合成基因簇

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗革兰氏阳性菌抗生素盐屋霉素(Siomycin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

盐屋霉素(Siomycin)是4种具有相似结构的硫肽类抗生素分子的统称，可由链霉菌Streptomyces sioyaensis ATCC13989所产生。1959年，人们首次从S.sioyaensis的发酵产物中提取出Siomycin的粗品，10年之后人们对粗品进行了进一步的纯化，发现它是由主要成分Siomycin A和其他几个微量的组分Siomyin B，C，D组成的[J.Antibiot.1969，22，364；J.Antibiot.1980，33，1563]。盐屋霉素的分子结构与硫链丝菌素十分相似，仅两个与喹萘啶酸相连的氨基酸残基稍有不同。它含有两个大环结构(分别为26员环和27员环)，4个噻唑环，1个噻唑啉，一个四取代的哌啶和一个喹萘啶酸结构，整个分子共有17个手性中心。前体标记实验表明：其中噻唑、噻唑啉杂环来自于半胱氨酸，哌啶环由两个丝氨酸经酶催化后形成，喹萘啶酸由色氨酸衍生而来。

Siomycin对格兰氏阳性菌显示了很强的抗生素活性，在小鼠实验中也显示出显著的对肺炎球菌的抗性。但是，盐屋霉素水溶性不好，生物利用度较低，这大大限制了它的医药用途。人们希望能获得一些它的结构类似物，从中筛选出活性更好，更有利于实际使用的分子。由于盐屋霉素极其复杂的分子结构，即使是在有机合成化学高度发达的今天，通过化学全合成来获得产品也是一项艰巨的挑战。直到2008年才首次报道了盐屋霉素A的化学合成[Chem Asian J.2008 Jun2；3(6)：1013-25.]，整个合成过程操作繁琐，产率低下。通过化学合成所获得的结构类似物即使在活性和水溶性方面的性质得到改善，也可能因为合成的复杂性而使实际生产成本过高。

我们以微生物来源的盐屋霉素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成机制的研究揭示了其经由核糖体合成的生物合成机制，并揭示了包括喹萘啶酸在内的独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰盐屋霉素的生物合成途径，探索水溶性好、生物利用度高、活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。

发明内容：

本发明涉及一种由链霉菌Streptomyces sioyaensis ATCC13989产生的具有抗革兰氏阳性菌活性的抗生素——盐屋霉素(Siomycin)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。

本发明中整个基因簇共包含21个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中一个基因(sioH)负责编码盐屋霉素的前体肽，十个基因(sioO、sioM、sioJ、sioK、sioS、sioL、sioI、sioC、sioR、sioP)负责对sioH编码的前体肽进行后修饰，形成整个大环骨架；七个基因(sioF、SioA、SioE、SioB、SioD、SioU、SioP)负责以色氨酸为前体，合成喹萘啶酸结构单元；一个基因sioQ负责对形成的喹萘啶酸进行活化，在其他酶的催化作用下连接到大环骨架上，并最终形成分子中的第二个大环。

本发明还提供了一个编码氨基转移酶的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组成，命名为sioA，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11552-10491碱基处。

本发明还提供了一个脂肪水解酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组成，命名为sioB，其基因的核苷酸序列位于序列1中第12421-11597碱基处。

本发明还提供了一个编码天门冬酰胺合成酶的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组成，命名为sioC，其基因的核苷酸序列位于序列1中第14359-12500碱基处。

本发明还提供了一个编码酯环化酶的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为sioD，其基因的核苷酸序列位于序列1中第14789-14382碱基处。

本发明还提供了一个编码酰基-CoA脱水酶的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸序列组成，命名为sioE，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16066-14834碱基处。

本发明还提供了一个编码甲基转移酶的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列组成，命名为sioF，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16974-16090碱基处。